2.3.1. Phương pháp thu mẫu
Mẫu rơm rạ đƣợc lấy khoảng 100g cho vào túi nilon đã vô trùng, trên túi ghi rõ địa điểm thu mẫu và thời gian lấy mẫu. Mẫu đƣợc bảo quản trong đá lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản mẫu ở nhiệt độ 4 - 5 0C và tiến hành phân lập ngay trong 48h.
2.3.2. Phương pháp phân lập
Cân 5 - 10g rơm rạ cho vào bình tam giác chứa 50ml môi trƣờng dịch thể MT1 giữ trong tủ ấm ở 35 - 370C trong một ngày. Dùng pipet hút 1ml dịch rơm rạ này chuyển sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nƣớc biển đã thanh trùng, trộn đều, đƣợc dịch rơm rạ có độ pha loãng 10-2. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ hai, thu đƣợc dịch rơm rạ có độ pha loãng 10-3
. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ ba, thu đƣợc dịch rơm rạ có độ pha loãng 10-4
. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ tƣ, thu đƣợc dịch rơm rạ có độ pha loãng 10-5. Dùng pipette hút 100µl dịch rơm rạ có độ pha loãng 10-4
, 10-5 nhỏ lên bề mặt thạch trong hộp petri chứa môi trƣờng phân lập MT2, trang đều dịch rơm rạ trên bề mặt thạch, sau đó gói các hộp petri lại và đặt trong tủ ấm 32 - 33ºC. Sau 24 - 48h khi vi khuẩn đã mọc tốt, lựa chọn trên hộp petri phân lập các khuẩn lạc mọc riêng rẽ để cấy chuyển sang hộp petri giữ giống chứa môi trƣờng MT2 đặc. Với mỗi khuẩn lạc, dùng một que tăm nhọn đã sấy vô
trùng lấy một lƣợng nhỏ vi khuẩn, cấy lên một ô vuông đã đánh số trên hộp petri giữ giống, nhƣ vậy mỗi ô số sẽ tƣơng ứng với một chủng vi khuẩn phân lập đƣợc. Với khuẩn lạc mọc loang thì ta cấy riêng ra ống nghiệm. Để trong tủ ấm 1 - 2 ngày, sau đó giữ giống trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC [9].
2.3.3. Phương pháp giữ giống vi khuẩn
2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền định kỳ
Tiến hành cấy truyền các chủng vi khuẩn giống định kỳ 1.5 - 2 tháng một lần trên ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trƣờng MT2, đặt trong tủ ấm 32 - 33ºC, sau 1- 2 ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt thì chuyển sang giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC.
2.3.3.2. Phương pháp lạnh đông bằng 15% glycerol
Nuôi cấy các chủng vi khuẩn giống trên môi trƣờng MT2 đặc đến khi mọc tốt, dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn cho vào eppendorf có chứa sẵn 1ml dịch 15% glycerol vô trùng, ghi tên chủng vào eppendorf, bọc kín miệng eppendorf bằng parafilm và giữ trong tủ lạnh -80ºC.
2.3.3.3. Phương pháp đông khô
Nuôi cấy các chủng vi khuẩn giống trên môi trƣờng MT2 đặc đến khi mọc tốt, dùng que cấy lấy một ít sinh khối tế bào hòa vào dung dịch sữa tách bơ, chia vào các ống đông khô, đông khô sinh khối bằng máy Plexy Dry (Mỹ) sau đó hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh -20ºC.
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có tích lũy PHA bằng thuốc nhuộm Nile blue A và quan sát dưới kính hiển vi điện tử để phát hiện các hạt dự trữ
Chuẩn bị môi trƣờng MT3 đặc có bổ sung 0.5µg/ml dung dịch thuốc nhuộm Nile blue A tan trong DMSO (Dimethylsulfoxide), chia đều môi trƣờng vào các hộp petri. Cấy chuyển vi khuẩn từ hộp petri giữ giống sang hộp petri chứa môi trƣờng có thuốc nhuộm đã đƣợc đánh số tƣơng ứng, đặt
các hộp petri này trong tủ ấm 32 - 33ºC. Sau 24 - 48h khi vi khuẩn đã mọc tốt, soi các hộp petri dƣới tia UV bƣớc sóng 254nm và quan sát, phát hiện các chủng vi khuẩn phát huỳnh quang màu vàng cam sáng (bright orange) [23].
2.3.5. Phương pháp lên men thu sinh khối của tế bào khô
Chuẩn bị môi trƣờng MT4 lỏng, bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa từ 13 - 15h vào trong bình tam giác 100ml chứa 25ml môi trƣờng trên. Đặt các bình tam giác trong tủ lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 350C trong 30h. Thu mẫu và xác định khối lƣợng khô của tế bào (CDW).
Giá trị CDW đƣợc xác định theo các bƣớc: Chuẩn bị eppendorf 2ml đƣợc đánh số thứ tự tƣơng ứng với các giống vi khuẩn, sấy khô đến khối lƣợng không đổi sau đó cân lên để xác định khối lƣợng Mo (g) của từng eppendorf, mỗi eppendorf hút 3 lần dịch nuôi cấy, mỗi lần hút 1.5ml cho vào eppendorf trên, li tâm 13000 vòng trong 5 phút, giữ lại sinh khối tế bào, sau đó rửa sinh khối bằng nƣớc cất, sấy khô eppendorf chứa sinh khối đến khối lƣợng không đổi sau đó cân eppendorf lần 2 để xác định giá trị M (g). Tính CDW theo công thức:
(g/l)
Sinh khối khô của tế bào trong mỗi mẫu thí nghiệm đƣợc giữ lại để phân tích hàm lƣợng PHA tích lũy.
2.3.6. Phương pháp sắc kí khí, phân tích hàm lượng PHA tích lũy trong tế bào vi khuẩn
Cân khoảng 10mg sinh khối khô của tế bào rồi trộn với 1ml dung dịch methanol chứa 15% (v/v) axit sulphuric + 0.4% (w/v) axit benzoic và 1ml chloroform. Thủy phân hỗn hợp trên ở 100 0C trong 3 giờ để chuyển hóa toàn bộ các thành phần có trong tế bào thành các methylester. Hỗn dịch sau đó đƣợc để nguội ở nhiệt độ phòng rồi bổ sung 0.5 ml nƣớc khử ion, trộn đều hỗn dịch trên này trên máy vortex trong 30s - 1 phút sau đó để hỗn dich tự
lắng. Dịch chloroform ở pha dƣới hòa tan các methyl ester đƣợc chuyển sang ống nghiệm mới để tiến hành phân tích hàm lƣợng PHA tích lũy trong tế bào bằng hệ thống sắc kí khí (GC) [15]. Mẫu PHA tich sạch của công ty Sigma đƣợc sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn.
Hình 2.1. Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng HB và kích thước đỉnh khi chạy sắc ký khí
Hình 2.2. Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng HV và kích thước đỉnh khi chạy sắc ký khí
2.3.7. Phương pháp mô tả hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn
Cấy vi khuẩn theo hình dích dắc trên môi trƣờng MT2 đặc, ủ ở 35 ºC trong 24h để vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc. Quan sát, lựa chọn các khuẩn lạc mọc riêng rẽ mô tả các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc.Làm tiêu bản nhuộm đơn, tiêu bản nhuộm Gram, quan sát và mô tả đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn trên kính hiển vi quang học.
2.3.8. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện môi trường đến khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
2.3.8.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trƣờng MT2 đặc ở các nhiệt độ khác nhau: 4ºC, 25ºC, 30ºC, 32ºC, 35ºC, 37ºC, 40ºC, 45ºC trong 24 - 48h, đánh giá khả năng sinh trƣởng thông qua đƣờng kính khuẩn lạc.
2.3.8.2. Hoạt hóa chủng nghiên cứu
Cấy chủng vi khuẩn nghiên cứu trên môi trƣờng MT2 đặc ở nhiệt độ 35ºC trong 24h, cấy chuyển sang môi trƣờng MT2 lỏng, nuôi trong máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35 ºC trong 13 - 15h, lúc này chủng vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa xong (giống vi khuẩn) sẵng sàng sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình.
2.3.8.3. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa vào các ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng MT4, pH thay đổi 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0. Đặt các ống nghiệm trong tủ lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35ºC (nghiêng các ống nghiệm một góc 45º so với giá lắc) trong 30h, pha loãng dịch nuôi cấy và xác định OD ở bƣớc sóng 600 nm.
2.3.8.4. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sự sinh trưởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Chuẩn bị môi trƣờng MT4, pH 7.0, với các nguồn cacbon khác nhau: glucose (20g/l), glucose (10g/l) + xylose (10g/l) và xylose (20g/l). Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa vào các bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trƣờng trên, nuôi lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35ºC trong 30h. Xác định khối lƣợng tế bào khô (CDW) và hàm lƣợng PHA (wt%) tích lũy trong tế bào.
Hàm lƣợng PHA tích lũy trong tế bào đƣợc xác định theo phƣơng pháp của sắc ký khí [27].
2.3.8.5. Động thái sinh trưởng và hàm lượng PHA tích lũy trong tế bào các chủng vi khuẩn tuyển chọn ở các thời điểm khác nhau
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa vào các bình tam giác 100ml chứa 30ml môi trƣờng MT4, pH 7.0 sử dụng nguồn cacbon là glucose (10g/l) + xylose (10g/l).
Đặt các bình tam giác nuôi cấy trong tủ lắc 35°C, 180 vòng/phút. Thu mẫu ở các thời điểm 0h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h, 54h.
Xác định khối lƣợng tế bào khô (CDW) và hàm lƣợng PHA (wt%) tích lũy trong tế bào.
2.3.9. Phương pháp thống kê toán học trong xử lý số liệu
Số liệu đƣợc thu thập sau mỗi thí nghiệm đảm bảo tính khách quan và chính xác.
Các số liệu thu thập đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft excel 2007.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ mục
Căn cứ vào mật độ vi khuẩn trong các mẫu rơm rạ mục thu đƣợc, chúng tôi chọn dịch rơm rạ có độ pha loãng 0.5x10-5
và 0.5x10-4 để phân lập, kết quả thu được 300 chủng vi khuẩn, đƣợc ký hiệu V1 đến V300.
Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn thu đƣợc qua 5 lần phân lập
STT Địa điểm Số chủng Ký hiệu
1 Xuân Hòa, Vĩnh Phúc 25 chủng V1 đến V25 2 Sóc Sơn, Hà Nội 95 chủng V26 đến V120 3 Sông Lô, Vĩnh Phúc 60 chủng V121 đến V180 4 Phúc Yên, Vĩnh Phúc 50 chủng V181 đến V230 5 Tam Đảo, Vĩnh Phúc 70 chủng V231 đến V300 Tổng: 300 chủng V1 đến V300
Tiến hành tuyển chọn chủng vi khuẩn có tích lũy PHA bằng phƣơng pháp tuyển chọn sử dụng thuốc nhuộm Nile blue A chọn đƣợc 23 chủng, quan sát vi khuẩn dƣới kính hiển vi bội giác 100 để phát hiện các hạt dự trữ, kết quả thu đƣợc 6 chủng để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.2. Các chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng sử dụng thuốc nhuộm Nile blue A và quan sát dƣới kính hiển vi quang học
Các chủng tuyển chọn
Thử với thuốc nhuộm Nile blue A
Soi dƣới kính viển vi bội giác 100
V41 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V54 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt
V63 Phát sáng màu vàng cam Tích lũy hạt
V82 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V84 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V91 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V126 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V133 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V149 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt
V150 Phát sáng màu vàng cam Tích lũy hạt V151 Phát sáng màu vàng cam Tích lũy hạt
V152 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt
V182 Phát sáng màu vàng cam Tích lũy hạt
V184 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V232 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt
V234 Phát sáng màu vàng cam Tích lũy hạt
V237 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V245 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V246 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V249 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V274 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt
V284 Phát sáng màu vàng cam Tích lũy hạt
Để khẳng định kết quả tuyển chọn và chọn ra chủng có khả năng sinh PHA nhiều nhất, chúng tôi tiến hành lên men thu sinh khối tế bào và phân tích hàm lƣợng PHA tích lũy trong tế bào vi khuẩn bằng phƣơng pháp sắc ký khí.
Hình 3.1. Khả năng sinh sinh khối và tích lũy PHBV trong các chủng vi khuẩn
Chúng tôi nhận thấy các chủng đều có khả năng sinh trưởng phát triển và tích lũy PHA. Các chủng V63 và V182 có khả năng sinh trưởng phát triển mạnh nhất, kh i lượng tế bào khô của các chủng này l n lượt là 3,03 và 5,45. Đồng thời với khả năng sinh trưởng, hai chủng V63 và V182 cũng là các chủng có khả năng tích lũy PHA cao nhất với hàm lượng l n lượt là 48,19% và 66,79%. Do đó chúng tôi chọn 2 chủng V63 và V182 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn chọn
3.2.1. Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Qua 24h nuôi cấy các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trƣờng MT2 đặc ta thu đƣợc các khuẩn lạc mọc trên đĩa peptri nhƣ hình 3.2.
a b
Hình 3.2. Khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường MT2 đặc (a - khuẩn lạc vi khuẩn V63, b - khuẩn lạc vi khuẩn V182)
Kết quả cho thấy: khuẩn lạc của chủng V63 có dạng tròn, không đều, mép gợn sóng, có nhân ở giữa, màu trắng, không nhẵn; khuẩn lạc của chủng V182 có dạng tròn, bóng và nhày ướt, màu vàng chanh.
3.2.2. Hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Để biết đƣợc chủng vi khuẩn tuyển chọn có hình dạng nhƣ thế nào chúng tôi tiến hành nhuộm gram các chủng vi khuẩn tuyển chọn, quan sát dƣới kính hiển vi bội giác 100 để quan sát hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn.
a b
Hình 3.3. Ảnh chụp qua kính hiển quang học với độ phóng đại 1000 cho thấy hình thái tế bào và hạt PHA tích lũy trong tế bào vi khuẩn
(a - chủng vi khuẩn V63, b - chủng vi khuẩn V182)
Ảnh kính hiển vi quang học cho thấy: chủng V63 là trực khuẩn to dài, bắt màu hồng khi nhuộm Gram chứng tỏ chúng thuộc vi khuẩn Gram âm; chủng V182 là trực khuẩn dài, có khả năng sinh bào tử, bắt màu hồng khi nhuộm Gram chứng tỏ chúng thuộc vi khuẩn Gram âm.
3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Nhiệt độ là tác nhân vật lý có ảnh hƣởng sâu sắc đến tốc độ của các phản ứng hóa sinh trong tế bào vi sinh vật [9], vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của chủng V63 và V182 nhằm tìm ra khoảng nhiệt độ tối ƣu để áp dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng V182
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đế sự sinh trưởng của chủng V63
Kết quả cho thấy chủng V63, V182 có khả năng sinh trƣởng, phát triển trên khoảng nhiệt độ rộng. Ở 4ºC sau 2 ngày nuôi cấy đã thấy vi khuẩn mọc lên, tuy rằng mọc kém. Trong khoảng nhiệt độ từ 25ºC đến 45ºC chủng V63, V182 đều mọc khá t t và mọc t t nhất ở 35 - 40ºC. Căn cứ vào khoảng nhiệt độ t i ưu này có thể kết luận chủng V63, V182 thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm trung bình [9]. Chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 35ºC để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo
3.4. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
pH của môi trƣờng ảnh hƣởng đến sự phân li của các ion, đến cấu trúc và hoạt tính của protein nên có ý nghĩa quyết định đến sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp các chất của vi khuẩn [8]. Xuất phát từ lý do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hƣởng của pH đến chủng V63 và V182, kết quả thể hiện trong hình 3.6 và hình 3.7.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của chủng V182
Kết quả cho thấy chủng V63 và V182 sinh trưởng, phát triển trên tất cả các pH mà nghiên cứu tiến hành (5.0 đến 8.0). Tuy nhiên sự sinh trưởng đạt t t nhất ở pH 7.5 - 8.0 chứng tỏ 2 chủng này thuộc nhóm vi sinh vật ưa kiềm nhẹ. Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn pH 7.5 để tiến hành