Việt Nam
Polymer sinh học đƣợc các nhà khoa học trên thế giới bắt đầu nghiên cứu vào những năm 1970 của thế kỷ 20 và có thể đƣợc chia thành nhiều giai đoạn. Giai đoạn 1970 - 1990 đƣợc xem là giai đoạn khởi thủy của các nghiên cứu về 35 vật liệu polymer sinh học với số lƣợng sáng chế đăng ký rất khiêm tốn (năm có số lƣợng sáng chế nhiều nhất là 1989 với 52 sáng chế, năm có số lƣợng sáng chế ít nhất là 1979, 1983 với 1 sáng chế). Giai đoạn 1991 - 2000 đƣợc xem là giai đoạn cao trào của các nghiên cứu về polymer sinh học với số lƣợng sáng chế tăng lên liên tục (năm 1991 - 1992 tăng từ 140 lên 233 sáng chế, 1994 - 1995 tăng từ 270 lên 373 sáng chế). Giai đoạn 2001 - 2010 là giai đoạn có số lƣợng sáng chế tăng vọt lên đến đỉnh điểm (năm 2003 có số lƣợng sáng chế nhiều nhất là 645 sáng chế). Từ năm 2006 trở về sau, số lƣợng sáng chế giảm dần, năm 2010 chỉ còn 154 sáng chế đƣợc đăng ký [4].
Ngày nay, trƣớc yêu cầu cấp thiết của việc giải quyết bài toán ô nhiễm môi trƣờng do nhựa không tự phân hủy gây ra, các hƣớng nghiên cứu và ứng dụng polymer sinh học ngày càng đƣợc đề cao. Tuy nhiên do giá thành sản xuất cao (gấp khoảng 2 đến 4 lần so với polymer hông tự phân hủy) nên việc
nghiên cứu ứng dụng polymer sinh học rộng rãi vào trong đời sống còn nhiều hạn chế. Hiện nay các nhà khoa học trên thế giới đang nỗ lực nghiên cứu nhằm giảm giá thành của polymer sinh học, trong đó các hƣớng nghiên cứu chủ yếu là: tìm ra các chủng vi sinh vật có khả năng tạo ra hàm lƣợng polymer lớn từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền nhƣ cám mỳ, lõi ngô, rỉ mật…, tối ƣu hóa các qui trình sản xuất để đạt đƣợc hiệu suất cao hay tạo ra các dòng sinh vật chuyển gen có khả năng tạo ra nhiều polymer. Các công ty thƣơng mại cũng tham gia trong lĩnh vực này, trên toàn thế giới hiện có khoảng 24 công ty đƣợc biết đến là có tham gia sản xuất và ứng dụng PHA (bảng 1.9) [10]. Sản phẩm từ polymer sinh học cũng vô cùng đa dạng, từ những sản phẩm thông thƣờng nhƣ túi mua hàng, cốc nhựa, bao bì, chậu cây, tã lót cho trẻ em… đến các sản phẩm có độ bền cao nhƣ vỏ máy vi tính, vỏ máy nghe nhạc, vỏ đựng lốp ô tô dự trữ…. Đặc biệt hơn, do không gây phản ứng thải loại khi đƣợc cấy ghép vào cơ thể nên polymer sinh học có những ứng dụng quan trọng trong nghành y tế. Các sản phẩm nhƣ chỉ phẫu thuật, đĩa xƣơng, ống ghép mạch, van tim…là những ví dụ điển hình [27].
Bảng 1.9. Các công ty thƣơng mại tham gia nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng PHA
STT Tên công ty Loại
PHA Quy mô sản xuất (tấn/năm) Giai đoạn Ứng dụng 1 ICI, Vƣơng quốc Anh PHBV 300 1980 - 1990 Bao bì 2 Chemie Linz, Úc PHB 20 - 100 Những năm 1980 Bao bì và vỏ thuốc (y dƣợc) 3 BTF, Úc PHB 20 - 100 Những năm 1990 Nhƣ trên (nt)
4 Biomers, Đức PHB Không rõ Những năm
1990 tới nay nt 5 BASF, Đức PHB và PHBV Quy mô thí điểm 1980 - 2005 Trộn với Ecoflex
6 Metabolix, Mỹ loại PHA Một vài Không rõ 1980 đến nay Bao bì
7 Tepha, Mỹ Một vài
loại PHA
Không rõ 1990 đến nay Vật liệu cấy
ghép trong y tế
8 P&G, Mỹ Một vài
loại PHA Hợp đồng sản xuất
1980 - 2005 Bao bì 9 Monsanto, Mỹ PHB, PHBV Nhà máy sản xuất PHA Những năm 1990 Nguyên liệu thô 10 Kaneka, Nhật Một vài
loại PHA Không rõ Nt Bao bì
11 Mitsubishi,Nhật PHB 10 Nt Nt
12 Biocycles,
Brazil
PHB 100
1990 đến nay Nguyên liệu
thô
13 Bio-On, Italy PHA chƣa
tinh sạch
10,000 2008 đến nay nt
14 Zhejiang Tian
An, Trung Quốc
PHBV 2,000 1990 đến nay nt 15 Shandong Lukang, Trung Quốc Một vài loại PHA Quy mô thí nghiệm 2005 đến nay Nguyên liệu thô và sản phẩm dùng trong y tế
Ở Việt Nam, polymer sinh học vẫn còn là lĩnh vực khá mới mẻ nên mới chỉ đƣợc chú trọng nghiên cứu trong khoảng 10 năm trở lại đây. Các hƣớng nghiên cứu chủ yếu hiện nay là phối trộn tinh bột với một số hợp chất khác để tạo ra các polymer sinh học. Bộ môn Công nghệ hóa, trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu sản xuất polymer sinh học từ sự phối trộn tinh bột sắn và glycerol [32]. Viện hóa học Việt Nam hiện nay cũng đang tiến hành một số nghiên cứu sản xuất các polymer sinh học có nguồn gốc từ tinh bột và một số polymer khác nhƣ: polylactic acid, polycaprolacton, polyethylenglycol, polyglycolic acid [33]. Bộ môn công nghệ sinh học vi sinh, khoa sinh học, trƣờng đại học sƣ phạm Hà Nội đã tiến hành đề tài “ phân lập và nghiên cứu vi khuẩn sinh polyhydroxyalkanoates từ rừng ngập mặn miền Bắc Việt Nam” do Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (Nafosted) tài trợ trong gian đoạn 2010 - 2012, hàng trăm chủng vi khuẩn có khả năng tích lũy PHA đã đƣợc phân lập và tuyển chọn, trong số đó có 15 chủng có khả năng tổng hợp PHA với hàm lƣợng cao đang đƣợc tập trung nghiên cứu. Phần lớn các chủng này có khả năng tích lũy poly (3-hydroxybutyrate) (PHB), một số chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp co-polymer poly(3-hydroxyalkanoate-co- 3-hydroxyvalerate) (PHBV) [1, 27]. Hiện chƣa có một nghiên cứu nào về vi sinh vật sản xuất PHA phân lập từ rơm rạ mục.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn phân lập từ rơm rạ mục ở Xuân Hòa, Sông Lô, Phúc Yên, Tam Đảo (Vĩnh Phúc) và Sóc Sơn (Hà Nội).
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất
Các hóa chất pha chế môi trƣờng (xem bảng 2.1). Một số hóa chất khác: Thuốc nhuộm Nile blue A (Merck, Đức), chloroform (Merck, Đức), glyxerol (Merck, Đức), xylose (Merck, Đức), methanol (Merck, Đức)….
Bảng 2.1. Công thức của các loại môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu
STT Thành phần Môi trƣờng làm giàu vi sinh vật - MT1 (g/l) Môi trƣờng phân lập và giữ giống - MT2 (g/l) Môi trƣờng thử hoạt tính - MT3 (g/l) Môi trƣờng sản xuất PHA - MT4 (g/l) 1 NaCl - 5 5 5 2 Pepton 1 5 1 2 3 Cao thịt 1 5 1 2 4 Glucose - - 20 20
Ghi chú: Các thành phần của môi trƣờng đƣợc hòa tan trong 1000ml nƣớc cất. Riêng môi trƣờng MT4 sử dụng dung dịch đệm photphat 1M, pH 7. pH của môi trƣờng đƣợc điều chỉnh đến 7.0 bằng dung dịch NaOH 5M và HCl 5M. Môi trƣờng đặc đƣợc bổ sung 2% agar (20g/l).
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Tủ ấm vi sinh (Heraeus - Đức), tủ sấy (Heraeus - Đức), nồi hấp (TOMY - Nhật), máy lắc ổn nhiệt (BR300LF - Nhật), máy li tâm (Sorwall super T21 - Mỹ), pipet (lapsystem - Phần Lan), máy đo pH (MP200R - Thụy Sĩ), máy đo OD (1240 Shimazu - Nhật), máy cộng hƣởng từ hạt nhân (Bruker ARX500, Bruker, Sikerstrifen, Đức), máy soi gel (ETX-20-C), hệ thống Soxhlet (Trung Quốc)….
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu mẫu
Mẫu rơm rạ đƣợc lấy khoảng 100g cho vào túi nilon đã vô trùng, trên túi ghi rõ địa điểm thu mẫu và thời gian lấy mẫu. Mẫu đƣợc bảo quản trong đá lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản mẫu ở nhiệt độ 4 - 5 0C và tiến hành phân lập ngay trong 48h.
2.3.2. Phương pháp phân lập
Cân 5 - 10g rơm rạ cho vào bình tam giác chứa 50ml môi trƣờng dịch thể MT1 giữ trong tủ ấm ở 35 - 370C trong một ngày. Dùng pipet hút 1ml dịch rơm rạ này chuyển sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nƣớc biển đã thanh trùng, trộn đều, đƣợc dịch rơm rạ có độ pha loãng 10-2. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ hai, thu đƣợc dịch rơm rạ có độ pha loãng 10-3
. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ ba, thu đƣợc dịch rơm rạ có độ pha loãng 10-4
. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ tƣ, thu đƣợc dịch rơm rạ có độ pha loãng 10-5. Dùng pipette hút 100µl dịch rơm rạ có độ pha loãng 10-4
, 10-5 nhỏ lên bề mặt thạch trong hộp petri chứa môi trƣờng phân lập MT2, trang đều dịch rơm rạ trên bề mặt thạch, sau đó gói các hộp petri lại và đặt trong tủ ấm 32 - 33ºC. Sau 24 - 48h khi vi khuẩn đã mọc tốt, lựa chọn trên hộp petri phân lập các khuẩn lạc mọc riêng rẽ để cấy chuyển sang hộp petri giữ giống chứa môi trƣờng MT2 đặc. Với mỗi khuẩn lạc, dùng một que tăm nhọn đã sấy vô
trùng lấy một lƣợng nhỏ vi khuẩn, cấy lên một ô vuông đã đánh số trên hộp petri giữ giống, nhƣ vậy mỗi ô số sẽ tƣơng ứng với một chủng vi khuẩn phân lập đƣợc. Với khuẩn lạc mọc loang thì ta cấy riêng ra ống nghiệm. Để trong tủ ấm 1 - 2 ngày, sau đó giữ giống trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC [9].
2.3.3. Phương pháp giữ giống vi khuẩn
2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền định kỳ
Tiến hành cấy truyền các chủng vi khuẩn giống định kỳ 1.5 - 2 tháng một lần trên ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trƣờng MT2, đặt trong tủ ấm 32 - 33ºC, sau 1- 2 ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt thì chuyển sang giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC.
2.3.3.2. Phương pháp lạnh đông bằng 15% glycerol
Nuôi cấy các chủng vi khuẩn giống trên môi trƣờng MT2 đặc đến khi mọc tốt, dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn cho vào eppendorf có chứa sẵn 1ml dịch 15% glycerol vô trùng, ghi tên chủng vào eppendorf, bọc kín miệng eppendorf bằng parafilm và giữ trong tủ lạnh -80ºC.
2.3.3.3. Phương pháp đông khô
Nuôi cấy các chủng vi khuẩn giống trên môi trƣờng MT2 đặc đến khi mọc tốt, dùng que cấy lấy một ít sinh khối tế bào hòa vào dung dịch sữa tách bơ, chia vào các ống đông khô, đông khô sinh khối bằng máy Plexy Dry (Mỹ) sau đó hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh -20ºC.
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có tích lũy PHA bằng thuốc nhuộm Nile blue A và quan sát dưới kính hiển vi điện tử để phát hiện các hạt dự trữ
Chuẩn bị môi trƣờng MT3 đặc có bổ sung 0.5µg/ml dung dịch thuốc nhuộm Nile blue A tan trong DMSO (Dimethylsulfoxide), chia đều môi trƣờng vào các hộp petri. Cấy chuyển vi khuẩn từ hộp petri giữ giống sang hộp petri chứa môi trƣờng có thuốc nhuộm đã đƣợc đánh số tƣơng ứng, đặt
các hộp petri này trong tủ ấm 32 - 33ºC. Sau 24 - 48h khi vi khuẩn đã mọc tốt, soi các hộp petri dƣới tia UV bƣớc sóng 254nm và quan sát, phát hiện các chủng vi khuẩn phát huỳnh quang màu vàng cam sáng (bright orange) [23].
2.3.5. Phương pháp lên men thu sinh khối của tế bào khô
Chuẩn bị môi trƣờng MT4 lỏng, bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa từ 13 - 15h vào trong bình tam giác 100ml chứa 25ml môi trƣờng trên. Đặt các bình tam giác trong tủ lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 350C trong 30h. Thu mẫu và xác định khối lƣợng khô của tế bào (CDW).
Giá trị CDW đƣợc xác định theo các bƣớc: Chuẩn bị eppendorf 2ml đƣợc đánh số thứ tự tƣơng ứng với các giống vi khuẩn, sấy khô đến khối lƣợng không đổi sau đó cân lên để xác định khối lƣợng Mo (g) của từng eppendorf, mỗi eppendorf hút 3 lần dịch nuôi cấy, mỗi lần hút 1.5ml cho vào eppendorf trên, li tâm 13000 vòng trong 5 phút, giữ lại sinh khối tế bào, sau đó rửa sinh khối bằng nƣớc cất, sấy khô eppendorf chứa sinh khối đến khối lƣợng không đổi sau đó cân eppendorf lần 2 để xác định giá trị M (g). Tính CDW theo công thức:
(g/l)
Sinh khối khô của tế bào trong mỗi mẫu thí nghiệm đƣợc giữ lại để phân tích hàm lƣợng PHA tích lũy.
2.3.6. Phương pháp sắc kí khí, phân tích hàm lượng PHA tích lũy trong tế bào vi khuẩn
Cân khoảng 10mg sinh khối khô của tế bào rồi trộn với 1ml dung dịch methanol chứa 15% (v/v) axit sulphuric + 0.4% (w/v) axit benzoic và 1ml chloroform. Thủy phân hỗn hợp trên ở 100 0C trong 3 giờ để chuyển hóa toàn bộ các thành phần có trong tế bào thành các methylester. Hỗn dịch sau đó đƣợc để nguội ở nhiệt độ phòng rồi bổ sung 0.5 ml nƣớc khử ion, trộn đều hỗn dịch trên này trên máy vortex trong 30s - 1 phút sau đó để hỗn dich tự
lắng. Dịch chloroform ở pha dƣới hòa tan các methyl ester đƣợc chuyển sang ống nghiệm mới để tiến hành phân tích hàm lƣợng PHA tích lũy trong tế bào bằng hệ thống sắc kí khí (GC) [15]. Mẫu PHA tich sạch của công ty Sigma đƣợc sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn.
Hình 2.1. Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng HB và kích thước đỉnh khi chạy sắc ký khí
Hình 2.2. Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng HV và kích thước đỉnh khi chạy sắc ký khí
2.3.7. Phương pháp mô tả hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn
Cấy vi khuẩn theo hình dích dắc trên môi trƣờng MT2 đặc, ủ ở 35 ºC trong 24h để vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc. Quan sát, lựa chọn các khuẩn lạc mọc riêng rẽ mô tả các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc.Làm tiêu bản nhuộm đơn, tiêu bản nhuộm Gram, quan sát và mô tả đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn trên kính hiển vi quang học.
2.3.8. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện môi trường đến khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
2.3.8.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trƣờng MT2 đặc ở các nhiệt độ khác nhau: 4ºC, 25ºC, 30ºC, 32ºC, 35ºC, 37ºC, 40ºC, 45ºC trong 24 - 48h, đánh giá khả năng sinh trƣởng thông qua đƣờng kính khuẩn lạc.
2.3.8.2. Hoạt hóa chủng nghiên cứu
Cấy chủng vi khuẩn nghiên cứu trên môi trƣờng MT2 đặc ở nhiệt độ 35ºC trong 24h, cấy chuyển sang môi trƣờng MT2 lỏng, nuôi trong máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35 ºC trong 13 - 15h, lúc này chủng vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa xong (giống vi khuẩn) sẵng sàng sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình.
2.3.8.3. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa vào các ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng MT4, pH thay đổi 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0. Đặt các ống nghiệm trong tủ lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35ºC (nghiêng các ống nghiệm một góc 45º so với giá lắc) trong 30h, pha loãng dịch nuôi cấy và xác định OD ở bƣớc sóng 600 nm.
2.3.8.4. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sự sinh trưởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Chuẩn bị môi trƣờng MT4, pH 7.0, với các nguồn cacbon khác nhau: glucose (20g/l), glucose (10g/l) + xylose (10g/l) và xylose (20g/l). Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa vào các bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trƣờng trên, nuôi lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35ºC trong 30h. Xác định khối lƣợng tế bào khô (CDW) và hàm lƣợng PHA (wt%) tích lũy trong tế bào.
Hàm lƣợng PHA tích lũy trong tế bào đƣợc xác định theo phƣơng pháp của sắc ký khí [27].
2.3.8.5. Động thái sinh trưởng và hàm lượng PHA tích lũy trong tế bào các chủng vi khuẩn tuyển chọn ở các thời điểm khác nhau
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa vào các bình tam giác 100ml chứa 30ml môi trƣờng MT4, pH 7.0 sử dụng nguồn cacbon là glucose (10g/l) + xylose (10g/l).
Đặt các bình tam giác nuôi cấy trong tủ lắc 35°C, 180 vòng/phút. Thu mẫu ở các thời điểm 0h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h, 54h.
Xác định khối lƣợng tế bào khô (CDW) và hàm lƣợng PHA (wt%) tích lũy trong tế bào.
2.3.9. Phương pháp thống kê toán học trong xử lý số liệu
Số liệu đƣợc thu thập sau mỗi thí nghiệm đảm bảo tính khách quan và chính xác.
Các số liệu thu thập đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft excel 2007.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ