Để biết đƣợc chủng vi khuẩn tuyển chọn có hình dạng nhƣ thế nào chúng tôi tiến hành nhuộm gram các chủng vi khuẩn tuyển chọn, quan sát dƣới kính hiển vi bội giác 100 để quan sát hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn.
a b
Hình 3.3. Ảnh chụp qua kính hiển quang học với độ phóng đại 1000 cho thấy hình thái tế bào và hạt PHA tích lũy trong tế bào vi khuẩn
(a - chủng vi khuẩn V63, b - chủng vi khuẩn V182)
Ảnh kính hiển vi quang học cho thấy: chủng V63 là trực khuẩn to dài, bắt màu hồng khi nhuộm Gram chứng tỏ chúng thuộc vi khuẩn Gram âm; chủng V182 là trực khuẩn dài, có khả năng sinh bào tử, bắt màu hồng khi nhuộm Gram chứng tỏ chúng thuộc vi khuẩn Gram âm.
3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Nhiệt độ là tác nhân vật lý có ảnh hƣởng sâu sắc đến tốc độ của các phản ứng hóa sinh trong tế bào vi sinh vật [9], vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của chủng V63 và V182 nhằm tìm ra khoảng nhiệt độ tối ƣu để áp dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng V182
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đế sự sinh trưởng của chủng V63
Kết quả cho thấy chủng V63, V182 có khả năng sinh trƣởng, phát triển trên khoảng nhiệt độ rộng. Ở 4ºC sau 2 ngày nuôi cấy đã thấy vi khuẩn mọc lên, tuy rằng mọc kém. Trong khoảng nhiệt độ từ 25ºC đến 45ºC chủng V63, V182 đều mọc khá t t và mọc t t nhất ở 35 - 40ºC. Căn cứ vào khoảng nhiệt độ t i ưu này có thể kết luận chủng V63, V182 thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm trung bình [9]. Chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 35ºC để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo
3.4. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
pH của môi trƣờng ảnh hƣởng đến sự phân li của các ion, đến cấu trúc và hoạt tính của protein nên có ý nghĩa quyết định đến sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp các chất của vi khuẩn [8]. Xuất phát từ lý do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hƣởng của pH đến chủng V63 và V182, kết quả thể hiện trong hình 3.6 và hình 3.7.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của chủng V182
Kết quả cho thấy chủng V63 và V182 sinh trưởng, phát triển trên tất cả các pH mà nghiên cứu tiến hành (5.0 đến 8.0). Tuy nhiên sự sinh trưởng đạt t t nhất ở pH 7.5 - 8.0 chứng tỏ 2 chủng này thuộc nhóm vi sinh vật ưa kiềm nhẹ. Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn pH 7.5 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Đa số vi khuẩn chỉ tích lũy PHA khi trong môi trƣờng nuôi cấy dƣ thừa cacbon, điều đó chỉ ra vai trò rất quan trọng của nguồn cacbon đối với các chủng này. Nhiều nghiên cứu cho thấy giá thành của nguồn cacbon quyết định đáng kể tới giá thành của sản phẩm PHA [27, 10], do đó việc nghiên cứu tìm ra nguồn cacbon vừa có ảnh hƣởng tốt tới sự sinh trƣởng, phát triển của chủng vi khuẩn tuyển chọn, vừa rẻ tiền là việc làm cần thiết. Mục đích của nghiên cứu này là phân lập đƣợc các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng rơm rạ thủy phân để sản xuất nhựa sinh học. Trong thành phần của rơm rạ thủy phân có đƣờng glucose và xylose là chủ yếu (chiếm 90% tổng lƣợng carbon -
tuyển chọn này trên môi trƣờng có nguồn các bon là glucose và xylose nhằm đánh giá khả năng chuyển hóa các nguồn đƣờng này thành nhựa sinh học.
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng và tích lũy PHA của chủng vi khuẩn V182
Hình 3.8. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon đến sự sinh trưởng và tích lũy hạt PHA của chủng vi khuẩn V63
Kết quả cho thấy chủng V63 và V182 sinh trưởng, phát triển và tích lũy PHA trên cả glucose, xylose và hỗn hợp glucose và xylose, tuy nhiên chúng sinh trưởng và tổng hợp nhiều PHBV nhất trên nguồn các bon là glucose
(hình 3.8 và 3.9). Khi sử dụng nguồn cacbon là glucose thì khối lƣợng tế bào khô của các chủng này lần lƣợt là 3,03 (chủng V63) và 5,45 (chủng V182). Đồng thời với khả năng sinh trƣởng tốt nhất thì khả năng tích lũy PHA cũng cao nhất với hàm lƣợng lần lƣợt là 48,19% (V63) và 66,79% (V182). Khi sử dụng hỗn hợp glucose và xylose thì sự sinh trƣởng và khả năng tổng hợp PHBV của hai chủng đều giảm, tuy nhiên kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hai chủng này có khả năng sử dụng từng loại đƣờng riêng lẻ hoặc sử dụng hỗn hợp hai loại đƣờng này, nhƣ vậy chúng ta có thể sử dụng phụ phẩm nông nghiệp ví dụ nhƣ rơm rạ thủy phân để sản xuất PHBV nhờ 2 chủng vi khuẩn này.
3.6. Động thái sinh trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Trong các yếu tố ảnh hƣởng tới sinh khối tế bào và hàm lƣợng PHA tích lũy thì thời gian là một yếu tố rất quan trọng. Kế thừa các kết quả nghiên cứu đi trƣớc nhƣ nghiên cứu của Nguyễn Thị Bình, chúng tôi chọn mốc thời gian 30h để tiến hành nghiên cứu ở các thí nghiệm trƣớc. Nhƣng trong quá trình làm thí nghiệm chúng tôi nhận thấy ở các thời điểm khác nhau tốc độ sinh trƣởng và khả năng tích lũy PHB của các chủng tuyển chọn là khác nhau. Việc tìm ra thời điểm nào chủng có khả năng sinh trƣởng tốt nhất và tích lũy PHA cao nhất có ý nghĩa rất lớn trong quá trình làm thí nghiệm và trong thực tế. Và để khảo sát lại kết quả nghiên cứu kế thừa trƣớc đó chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu động thái sinh trƣởng và tích lũy PHA trong tế bào các chủng tuyển chọn sử dụng phối hợp glucose và xylose làm nguồn cacbon.
Hình 3.11. Động thái sinh trưởng và khả năng tích lũy PHA của chủng vi khuẩn V182
Hình 3.10. Động thái sinh trưởng và khả năng tích lũy PHA của chủng vi khuẩn V63
Kết quả cho thấy ở thời điểm 30 - 36h sau khi giống đƣợc đƣa vào môi trƣờng lên men, cả 2 chủng V63 và V182 đều sinh trƣởng và tích lũy PHA đạt giá trị cực đại.
Đ i với chủng V63 trong quá trình nuôi cấy, qu n thể vi khuẩn và sự tích lũy PHBV tăng d n và đạt giá trị cực đại tại thời điểm 30h (2,72g/l sinh kh i tế bào khô và 49,64% PHBV). Từ 36 - 54 h quần thể vi khuẩn và tích lũy PHBV giảm dần, trong đó ở thời điểm 54h là thấp nhất (1,58 g/l sinh khối tế bào khô và 19,89% PHBV) (Hình 3.10).
Cũng tương tự như chủng V63, sự sinh trưởng và tích lũy PHBV của chủng V182 cũng tăng d n theo thời gian nghiên cứu và đạt giá trị cực đại tại thời điểm 30h (3,2g/l sinh kh i tế bào khô và 53,01% PHBV). Từ 36 - 54 h quần thể sinh trƣởng và tích lũy PHBV giảm dần, trong đó ở thời điểm 54h là thấp nhất (1,78 g/l sinh khối tế bào khô và 27,7% PHBV) (Hình 3.11).
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
1.1. Chúng tôi đã phân lập đƣợc 300 chủng vi khuẩn từ các mẫu rơm rạ
mục thu thập đƣợc ở Vĩnh Phúc và địa bàn lân cận, từ các chủng vi khuẩn này chúng tôi đã tuyển chọn đƣợc 2 chủng vi khuẩn (V63 và V182) có khả năng sinh trƣởng mạnh và tích lũy nhiều hạt PHA trong tế bào để tiến hành các nghiên cứu sâu hơn.
1.2. Chủng V63 và V182 thuộc nhóm gram âm, ƣa ấm trung bình và ƣa
kiềm nhẹ, có khả năng sinh tổng hợp PHA từ glucose và xylose trong đó tốt nhất là từ glucose. Loại PHA mà 2 chủng này tích lũy là poly(3- hydroxybutyrate) (PHB) và poly(3-hydroxyvalerate) (PHV) tạo thành copolymer PHBV.
1.3. Trên môi trƣờng nuôi cấy có sử dụng nguồn các bon là glucose và
xylose, hai chủng này sinh trƣởng và tích lũy PHBV cực đại sau 30 h nuôi cấy, tại thời điểm này hàm lƣợng PHBV đạt cực đại là 49,64% (chủng V63) và 53,01% (chủng V182).
2. KIẾN NGHỊ
Chủng V63 và V182 có nhiều tiềm năng ứng dụng sản xuất polymer sinh học ở Việt Nam, cần có những nghiên cứu cụ thể tiếp theo để có thể tối ƣu hóa quy trình lên men kết hợp với việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp thủy phân để đƣa 2 chủng này vào sản xuất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1]. Đoàn Văn Thƣợc, Nguyễn Thị Bình (2012) Đặc điểm của chủng vi khuẩn NĐ153 sinh polyhydroxybultyrate (PHB) phân lập từ đất rừng ngập mặn huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định. Tạp chí Công nghệ học
10(1): 169-178.
[2]. Đoàn Văn Thƣợc, Trần Hữu Phong (2010) Nhựa phân hủy sinh học từ vi khuẩn - Polyhydroxyalkanoates. Báo cáo khoa học. Đại học sƣ phạm Hà Nội.
[3]. Nguyễn Thị Bình (2011) Phân lập và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn sinh polyhydroxyalkanoate (PHA) từ đất rừng ngập mặn huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định. Khóa luận t t nghiệp. Khoa sinh học. Đại học sƣ phạm Hà Nội.
[4]. Linh Thảo (2011), Nhựa phân hủy sinh học trên đà phát triển, Thông tin Khoa học & Công nghệ (CESTI) - Sở KH&CN TP.HCM, Số 11, trang 10-13.
[5]. Lƣu Thị Hồi (2012), Nghiên cứu tối ƣu hóa môi trƣờng lên men sinh tổng hợp PHB và các điều kiện tinh sạch PHB từ chủng vi khuẩn Yangia sp. NĐ 199 qui mô phòng thí nghiệm. Luận văn thạc sỹ. Khoa sinh học. Đại học sƣ phạm Hà Nội.
[6]. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vƣơng Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh sinh vật học. Nxb Đại học sư phạm.
[7]. Nguyễn Thị Bình (2013) Nghiên cứu thành phần môi trƣờng lên men và điều kiện tách chiết, tinh sạch polyhydroxyalkanoate (PHA) từ chủng vi khuẩn QN271. Luận văn thạc sĩ. Khoa sinh học. Đại học sƣ phạm Hà Nội.
[8]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học. NXB Giáo dục.
[9]. Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng (2000). Sinh học vi sinh vật. NXB Giáo dục. phế thải nông n
B.TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[10]. Chen GQ (2010) Plastics from Bacteria. Springer Heidelberg Dordrecht London New York. p19-21, p23-24.
[11]. Choi J, Lee SY (1999) Factors affecting the economics of polyhydroxyalkanoate production by bacterial fermentation. Appl Microbiol Biotechnol 51:13-21.
[12]. Diep NQ, Fujimoto S, Minowa T, Sakanishi K, Nakagoshi N (2012) Estimation of the potential of rice straw for ethanol production and the optimum facility size for different regions in Vietnam. Appl Energy
93:205-211.
[13]. Gilmour D (1990) Halotolerant and halophilic microorganisms. In: Edwards C (ed) Microbiology of Extreme Environments. McGraw Hill Publishing Co, NewYork. p 147-177.
[14]. Hang MT, Hoa PTT (2004) Study on diversity of the Aspergillus strains isolated from the mangrove forests in Nam Dinh and Thai Binh Provinces. In: Hong PN (ed) Mangrove Ecosystem in the Red River Coastal Zone. Biodiversity, Ecology, Socio-economics, Management and education. Agricultural Publishing House, HaNoi. p47-56.
[15]. Huijberts GNM, Vanderwal H, Wilkinson C, Eggink G (1994) Gas- chromatographic analysis of poly(3 hydroxyalkanoates) in bacterial.
Biotechnol. Technol. 8:187.
[16]. Lee SY (1996) Plastic bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in acteria. Trends Biotechnol 14:431-438.
[17]. Madison LL, Huisman GW (1999) Metabolic engineering of poly(3- hydroxyalkanoates): from DNA to plastic. Microbiol Mol Biol Rev 63:21-53.
[18]. Peters V, Rehm BHA (2005) In vivo monitoring of PHA granule formation using GFP-labeled PHA synthases. FEMS Microbiol Lett
248, 93-100.
[19]. Philip S, Keshavarz T, Roy I (2007) Polyhydroxyalkanoates: biodegradable polymers with a range of applications. J Chem Technol Biotechnol 82:233-247
[20]. Quillaguamán J, Van-Thuoc D, Guzmán H, Guzmán D, Martín J, Everest A, Hatti-Kaul R (2008) Poly(3-hydroxybutyrate) production by
Halomonas boliviensis in fed-batch culture. Appl Microbiol Biotechnol
78:227-232.
[21]. Reddy C.S.K, Ghai R, Rashmi, Kalia V.C (2003). Polyhydroxyalkanoates: an overview. Biochemical Technology 137-146.
[22]. Sarkar N, Ghosh SK, Bannerjee S, Aikat K (2012) Bioethanol production from agricultural waste: An overview. Renewable Energy
37:19-27.
[23]. Spiekermann P, Rehm BHA., Kalscheuer R, Baumeister D, Steinbüchel A (1999) A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds. Arch Microbiol 171:73-80.
[24]. Tajima K, Igari T, Nishimura D, Nakamura M, Satoh Y, Munekata M (2003) Isolation and characterization of Bacillus sp. INT005 accumulating polyhydroxyalkanoate (PHA) from gas field soil. J Biosci Bioeng 95:77-81.
[25]. Thirumala M, Reddy SV, MahmoodSK (2010) Production and characterization of PHB from two novel strains of Bacillus spp. isolated from soil and activated sludge. J Ind Microbiol Biotechnol 37:271-278. [26]. Valappil SP, Peiris D, Langley GJ, Herniman JM, BoccacciniAR, Bucke
C, Roy I (2007) Polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthesis from structurally unrelated carbon sources by a newly characterized Bacillus
spp. J Biotechnol 127:475-487.
[27]. Thuoc DV (2009) Production of poly (3-hydroxybutyrate) and ectoines using a halophilic bacterium. Doctoral thesis. LundUniversity, Lund, Sweden. p13-15, p18-21, p36.
[28]. Verlinden RAJ, Hill DJ, Kenward MA, Williams CD, Radecka I (2007) Bacterial synthesis of biodegradable polyhydroxyalkanoates. J Appl Microbiol 102: 1437–1449.
[29]. Wang F, Lee SY (1997) Poly (3-hydroxybutyrate) production with high productivity and high polymer content by a fed-batch culture of
Alcaligenes latus under nitrogen limitation. Appl Environ Microbiol
63:3703-3706. Webside: [30]. http://vst.vista.gov.vn/home/database/an_pham_dien_tu/MagazineNa me.2004-05-21.4429/2010/2010_00003/MArticle.2012-10 18.1937/marticle_view [31]. http://www.european-bioplastics.org [32]. http://sggp.org.vn/khoahoc_congnghe/2010/3/220038/ [33]. http://ich.ac.vn/Main.aspx?MNU=168&Style=1