Cấy chủng vi khuẩn nghiên cứu trên môi trƣờng MT2 đặc ở nhiệt độ 35ºC trong 24h, cấy chuyển sang môi trƣờng MT2 lỏng, nuôi trong máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35 ºC trong 13 - 15h, lúc này chủng vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa xong (giống vi khuẩn) sẵng sàng sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình.
2.3.8.3. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa vào các ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng MT4, pH thay đổi 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0. Đặt các ống nghiệm trong tủ lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35ºC (nghiêng các ống nghiệm một góc 45º so với giá lắc) trong 30h, pha loãng dịch nuôi cấy và xác định OD ở bƣớc sóng 600 nm.
2.3.8.4. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sự sinh trưởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Chuẩn bị môi trƣờng MT4, pH 7.0, với các nguồn cacbon khác nhau: glucose (20g/l), glucose (10g/l) + xylose (10g/l) và xylose (20g/l). Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa vào các bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trƣờng trên, nuôi lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35ºC trong 30h. Xác định khối lƣợng tế bào khô (CDW) và hàm lƣợng PHA (wt%) tích lũy trong tế bào.
Hàm lƣợng PHA tích lũy trong tế bào đƣợc xác định theo phƣơng pháp của sắc ký khí [27].
2.3.8.5. Động thái sinh trưởng và hàm lượng PHA tích lũy trong tế bào các chủng vi khuẩn tuyển chọn ở các thời điểm khác nhau
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa vào các bình tam giác 100ml chứa 30ml môi trƣờng MT4, pH 7.0 sử dụng nguồn cacbon là glucose (10g/l) + xylose (10g/l).
Đặt các bình tam giác nuôi cấy trong tủ lắc 35°C, 180 vòng/phút. Thu mẫu ở các thời điểm 0h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h, 54h.
Xác định khối lƣợng tế bào khô (CDW) và hàm lƣợng PHA (wt%) tích lũy trong tế bào.
2.3.9. Phương pháp thống kê toán học trong xử lý số liệu
Số liệu đƣợc thu thập sau mỗi thí nghiệm đảm bảo tính khách quan và chính xác.
Các số liệu thu thập đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft excel 2007.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ mục
Căn cứ vào mật độ vi khuẩn trong các mẫu rơm rạ mục thu đƣợc, chúng tôi chọn dịch rơm rạ có độ pha loãng 0.5x10-5
và 0.5x10-4 để phân lập, kết quả thu được 300 chủng vi khuẩn, đƣợc ký hiệu V1 đến V300.
Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn thu đƣợc qua 5 lần phân lập
STT Địa điểm Số chủng Ký hiệu
1 Xuân Hòa, Vĩnh Phúc 25 chủng V1 đến V25 2 Sóc Sơn, Hà Nội 95 chủng V26 đến V120 3 Sông Lô, Vĩnh Phúc 60 chủng V121 đến V180 4 Phúc Yên, Vĩnh Phúc 50 chủng V181 đến V230 5 Tam Đảo, Vĩnh Phúc 70 chủng V231 đến V300 Tổng: 300 chủng V1 đến V300
Tiến hành tuyển chọn chủng vi khuẩn có tích lũy PHA bằng phƣơng pháp tuyển chọn sử dụng thuốc nhuộm Nile blue A chọn đƣợc 23 chủng, quan sát vi khuẩn dƣới kính hiển vi bội giác 100 để phát hiện các hạt dự trữ, kết quả thu đƣợc 6 chủng để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.2. Các chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng sử dụng thuốc nhuộm Nile blue A và quan sát dƣới kính hiển vi quang học
Các chủng tuyển chọn
Thử với thuốc nhuộm Nile blue A
Soi dƣới kính viển vi bội giác 100
V41 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V54 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt
V63 Phát sáng màu vàng cam Tích lũy hạt
V82 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V84 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V91 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V126 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V133 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V149 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt
V150 Phát sáng màu vàng cam Tích lũy hạt V151 Phát sáng màu vàng cam Tích lũy hạt
V152 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt
V182 Phát sáng màu vàng cam Tích lũy hạt
V184 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V232 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt
V234 Phát sáng màu vàng cam Tích lũy hạt
V237 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V245 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V246 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V249 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt V274 Phát sáng màu vàng cam Không tích lũy hạt
V284 Phát sáng màu vàng cam Tích lũy hạt
Để khẳng định kết quả tuyển chọn và chọn ra chủng có khả năng sinh PHA nhiều nhất, chúng tôi tiến hành lên men thu sinh khối tế bào và phân tích hàm lƣợng PHA tích lũy trong tế bào vi khuẩn bằng phƣơng pháp sắc ký khí.
Hình 3.1. Khả năng sinh sinh khối và tích lũy PHBV trong các chủng vi khuẩn
Chúng tôi nhận thấy các chủng đều có khả năng sinh trưởng phát triển và tích lũy PHA. Các chủng V63 và V182 có khả năng sinh trưởng phát triển mạnh nhất, kh i lượng tế bào khô của các chủng này l n lượt là 3,03 và 5,45. Đồng thời với khả năng sinh trưởng, hai chủng V63 và V182 cũng là các chủng có khả năng tích lũy PHA cao nhất với hàm lượng l n lượt là 48,19% và 66,79%. Do đó chúng tôi chọn 2 chủng V63 và V182 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn chọn
3.2.1. Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Qua 24h nuôi cấy các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trƣờng MT2 đặc ta thu đƣợc các khuẩn lạc mọc trên đĩa peptri nhƣ hình 3.2.
a b
Hình 3.2. Khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường MT2 đặc (a - khuẩn lạc vi khuẩn V63, b - khuẩn lạc vi khuẩn V182)
Kết quả cho thấy: khuẩn lạc của chủng V63 có dạng tròn, không đều, mép gợn sóng, có nhân ở giữa, màu trắng, không nhẵn; khuẩn lạc của chủng V182 có dạng tròn, bóng và nhày ướt, màu vàng chanh.
3.2.2. Hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Để biết đƣợc chủng vi khuẩn tuyển chọn có hình dạng nhƣ thế nào chúng tôi tiến hành nhuộm gram các chủng vi khuẩn tuyển chọn, quan sát dƣới kính hiển vi bội giác 100 để quan sát hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn.
a b
Hình 3.3. Ảnh chụp qua kính hiển quang học với độ phóng đại 1000 cho thấy hình thái tế bào và hạt PHA tích lũy trong tế bào vi khuẩn
(a - chủng vi khuẩn V63, b - chủng vi khuẩn V182)
Ảnh kính hiển vi quang học cho thấy: chủng V63 là trực khuẩn to dài, bắt màu hồng khi nhuộm Gram chứng tỏ chúng thuộc vi khuẩn Gram âm; chủng V182 là trực khuẩn dài, có khả năng sinh bào tử, bắt màu hồng khi nhuộm Gram chứng tỏ chúng thuộc vi khuẩn Gram âm.
3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Nhiệt độ là tác nhân vật lý có ảnh hƣởng sâu sắc đến tốc độ của các phản ứng hóa sinh trong tế bào vi sinh vật [9], vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của chủng V63 và V182 nhằm tìm ra khoảng nhiệt độ tối ƣu để áp dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng V182
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đế sự sinh trưởng của chủng V63
Kết quả cho thấy chủng V63, V182 có khả năng sinh trƣởng, phát triển trên khoảng nhiệt độ rộng. Ở 4ºC sau 2 ngày nuôi cấy đã thấy vi khuẩn mọc lên, tuy rằng mọc kém. Trong khoảng nhiệt độ từ 25ºC đến 45ºC chủng V63, V182 đều mọc khá t t và mọc t t nhất ở 35 - 40ºC. Căn cứ vào khoảng nhiệt độ t i ưu này có thể kết luận chủng V63, V182 thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm trung bình [9]. Chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 35ºC để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo
3.4. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
pH của môi trƣờng ảnh hƣởng đến sự phân li của các ion, đến cấu trúc và hoạt tính của protein nên có ý nghĩa quyết định đến sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp các chất của vi khuẩn [8]. Xuất phát từ lý do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hƣởng của pH đến chủng V63 và V182, kết quả thể hiện trong hình 3.6 và hình 3.7.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của chủng V182
Kết quả cho thấy chủng V63 và V182 sinh trưởng, phát triển trên tất cả các pH mà nghiên cứu tiến hành (5.0 đến 8.0). Tuy nhiên sự sinh trưởng đạt t t nhất ở pH 7.5 - 8.0 chứng tỏ 2 chủng này thuộc nhóm vi sinh vật ưa kiềm nhẹ. Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn pH 7.5 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Đa số vi khuẩn chỉ tích lũy PHA khi trong môi trƣờng nuôi cấy dƣ thừa cacbon, điều đó chỉ ra vai trò rất quan trọng của nguồn cacbon đối với các chủng này. Nhiều nghiên cứu cho thấy giá thành của nguồn cacbon quyết định đáng kể tới giá thành của sản phẩm PHA [27, 10], do đó việc nghiên cứu tìm ra nguồn cacbon vừa có ảnh hƣởng tốt tới sự sinh trƣởng, phát triển của chủng vi khuẩn tuyển chọn, vừa rẻ tiền là việc làm cần thiết. Mục đích của nghiên cứu này là phân lập đƣợc các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng rơm rạ thủy phân để sản xuất nhựa sinh học. Trong thành phần của rơm rạ thủy phân có đƣờng glucose và xylose là chủ yếu (chiếm 90% tổng lƣợng carbon -
tuyển chọn này trên môi trƣờng có nguồn các bon là glucose và xylose nhằm đánh giá khả năng chuyển hóa các nguồn đƣờng này thành nhựa sinh học.
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng và tích lũy PHA của chủng vi khuẩn V182
Hình 3.8. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon đến sự sinh trưởng và tích lũy hạt PHA của chủng vi khuẩn V63
Kết quả cho thấy chủng V63 và V182 sinh trưởng, phát triển và tích lũy PHA trên cả glucose, xylose và hỗn hợp glucose và xylose, tuy nhiên chúng sinh trưởng và tổng hợp nhiều PHBV nhất trên nguồn các bon là glucose
(hình 3.8 và 3.9). Khi sử dụng nguồn cacbon là glucose thì khối lƣợng tế bào khô của các chủng này lần lƣợt là 3,03 (chủng V63) và 5,45 (chủng V182). Đồng thời với khả năng sinh trƣởng tốt nhất thì khả năng tích lũy PHA cũng cao nhất với hàm lƣợng lần lƣợt là 48,19% (V63) và 66,79% (V182). Khi sử dụng hỗn hợp glucose và xylose thì sự sinh trƣởng và khả năng tổng hợp PHBV của hai chủng đều giảm, tuy nhiên kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hai chủng này có khả năng sử dụng từng loại đƣờng riêng lẻ hoặc sử dụng hỗn hợp hai loại đƣờng này, nhƣ vậy chúng ta có thể sử dụng phụ phẩm nông nghiệp ví dụ nhƣ rơm rạ thủy phân để sản xuất PHBV nhờ 2 chủng vi khuẩn này.
3.6. Động thái sinh trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Trong các yếu tố ảnh hƣởng tới sinh khối tế bào và hàm lƣợng PHA tích lũy thì thời gian là một yếu tố rất quan trọng. Kế thừa các kết quả nghiên cứu đi trƣớc nhƣ nghiên cứu của Nguyễn Thị Bình, chúng tôi chọn mốc thời gian 30h để tiến hành nghiên cứu ở các thí nghiệm trƣớc. Nhƣng trong quá trình làm thí nghiệm chúng tôi nhận thấy ở các thời điểm khác nhau tốc độ sinh trƣởng và khả năng tích lũy PHB của các chủng tuyển chọn là khác nhau. Việc tìm ra thời điểm nào chủng có khả năng sinh trƣởng tốt nhất và tích lũy PHA cao nhất có ý nghĩa rất lớn trong quá trình làm thí nghiệm và trong thực tế. Và để khảo sát lại kết quả nghiên cứu kế thừa trƣớc đó chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu động thái sinh trƣởng và tích lũy PHA trong tế bào các chủng tuyển chọn sử dụng phối hợp glucose và xylose làm nguồn cacbon.
Hình 3.11. Động thái sinh trưởng và khả năng tích lũy PHA của chủng vi khuẩn V182
Hình 3.10. Động thái sinh trưởng và khả năng tích lũy PHA của chủng vi khuẩn V63
Kết quả cho thấy ở thời điểm 30 - 36h sau khi giống đƣợc đƣa vào môi trƣờng lên men, cả 2 chủng V63 và V182 đều sinh trƣởng và tích lũy PHA đạt giá trị cực đại.
Đ i với chủng V63 trong quá trình nuôi cấy, qu n thể vi khuẩn và sự tích lũy PHBV tăng d n và đạt giá trị cực đại tại thời điểm 30h (2,72g/l sinh kh i tế bào khô và 49,64% PHBV). Từ 36 - 54 h quần thể vi khuẩn và tích lũy PHBV giảm dần, trong đó ở thời điểm 54h là thấp nhất (1,58 g/l sinh khối tế bào khô và 19,89% PHBV) (Hình 3.10).
Cũng tương tự như chủng V63, sự sinh trưởng và tích lũy PHBV của chủng V182 cũng tăng d n theo thời gian nghiên cứu và đạt giá trị cực đại tại thời điểm 30h (3,2g/l sinh kh i tế bào khô và 53,01% PHBV). Từ 36 - 54 h quần thể sinh trƣởng và tích lũy PHBV giảm dần, trong đó ở thời điểm 54h là thấp nhất (1,78 g/l sinh khối tế bào khô và 27,7% PHBV) (Hình 3.11).
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
1.1. Chúng tôi đã phân lập đƣợc 300 chủng vi khuẩn từ các mẫu rơm rạ
mục thu thập đƣợc ở Vĩnh Phúc và địa bàn lân cận, từ các chủng vi khuẩn này chúng tôi đã tuyển chọn đƣợc 2 chủng vi khuẩn (V63 và V182) có khả năng sinh trƣởng mạnh và tích lũy nhiều hạt PHA trong tế bào để tiến hành các nghiên cứu sâu hơn.
1.2. Chủng V63 và V182 thuộc nhóm gram âm, ƣa ấm trung bình và ƣa
kiềm nhẹ, có khả năng sinh tổng hợp PHA từ glucose và xylose trong đó tốt nhất là từ glucose. Loại PHA mà 2 chủng này tích lũy là poly(3- hydroxybutyrate) (PHB) và poly(3-hydroxyvalerate) (PHV) tạo thành copolymer PHBV.
1.3. Trên môi trƣờng nuôi cấy có sử dụng nguồn các bon là glucose và
xylose, hai chủng này sinh trƣởng và tích lũy PHBV cực đại sau 30 h nuôi cấy, tại thời điểm này hàm lƣợng PHBV đạt cực đại là 49,64% (chủng V63) và 53,01% (chủng V182).
2. KIẾN NGHỊ
Chủng V63 và V182 có nhiều tiềm năng ứng dụng sản xuất polymer sinh học ở Việt Nam, cần có những nghiên cứu cụ thể tiếp theo để có thể tối ƣu hóa quy trình lên men kết hợp với việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp thủy phân để đƣa 2 chủng này vào sản xuất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1]. Đoàn Văn Thƣợc, Nguyễn Thị Bình (2012) Đặc điểm của chủng vi khuẩn NĐ153 sinh polyhydroxybultyrate (PHB) phân lập từ đất rừng ngập mặn huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định. Tạp chí Công nghệ học
10(1): 169-178.
[2]. Đoàn Văn Thƣợc, Trần Hữu Phong (2010) Nhựa phân hủy sinh học từ vi khuẩn - Polyhydroxyalkanoates. Báo cáo khoa học. Đại học sƣ phạm Hà Nội.
[3]. Nguyễn Thị Bình (2011) Phân lập và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn sinh polyhydroxyalkanoate (PHA) từ đất rừng ngập mặn huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định. Khóa luận t t nghiệp. Khoa sinh học. Đại học sƣ phạm Hà Nội.
[4]. Linh Thảo (2011), Nhựa phân hủy sinh học trên đà phát triển, Thông tin Khoa học & Công nghệ (CESTI) - Sở KH&CN TP.HCM, Số 11, trang 10-13.
[5]. Lƣu Thị Hồi (2012), Nghiên cứu tối ƣu hóa môi trƣờng lên men sinh tổng hợp PHB và các điều kiện tinh sạch PHB từ chủng vi khuẩn Yangia sp. NĐ 199 qui mô phòng thí nghiệm. Luận văn thạc sỹ. Khoa sinh học. Đại học sƣ phạm Hà Nội.
[6]. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vƣơng Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh sinh vật học. Nxb Đại học sư phạm.
[7]. Nguyễn Thị Bình (2013) Nghiên cứu thành phần môi trƣờng lên men và điều kiện tách chiết, tinh sạch polyhydroxyalkanoate (PHA) từ chủng vi khuẩn QN271. Luận văn thạc sĩ. Khoa sinh học. Đại học sƣ phạm Hà Nội.
[8]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học. NXB Giáo dục.
[9]. Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng (2000). Sinh học vi sinh vật. NXB Giáo dục. phế thải nông n