V.1 Thử nghiệm độc tính cao EtOAc và các chất PHUOC-TR-02;
PHUOC-TR-03 trên ấu trùng tôm (Brine Shrimp)
V.1.1 Hóa chất và dụng cụ
+ Dimethyl sulfoxide (DMSO), nước biển 35‰.
+ Giá đỡ và các ống nghiệm nhỏ có dung tích trên 5mL. + Pipette sử dụng 2 loại cone 5-500 µL và 1000-2000 µL . + Đèn soi
V.1.2 Thực nghiệm
Pha dung dịch mẫu thử nghiệm:
Lấy 1 lượng nhỏ DMSO để hòa tan mẫu trước rồi cho nước muối vào pha loãng ứng với các nồng độ chất: 1 (μg/mL), 10 (μg/mL), 50 (μg/mL), 100 (μg/mL) và 200 (μg/mL).
Chuẩn bị ấu trùng:
Cho trứng vào becher đã chứa sẵn dung dich nước biển 35‰ . Sau 48 giờ dùng pipette hút lấy ấu trùng.
Tiến hành thử nghiệm:
Dùng pipette hút lấy 10 ấu trùng cho vào mỗi ống chất thử nghiệm có nồng độ lần lượt là 1 (μg/mL), 10 (μg/mL), 50 (μg/mL), 100 (μg/mL) và 200 (μg/mL). Sau đó để yên 24 giờ.
Đếm ấu trùng: Dùng đèn soi để đếm số ấu trùng còn sống sót để tính số lượng ấu trùng bị chết. Tỷ lệ tử vong của ấu trùng khác nhau ở các nồng độ khác nhau.
V.1.3 Kết quả thử nghiệm
Thực hiện 3 lần thử nghiệm trên cao ethyl acetate và các chất PHUOC-TR-02; PHUOC-TR-03 ly trích từ rễ mắm cho kết quả sau:
Bảng 6: Kết quả thử nghiệm lần 1
Các loại mẫu
Số lượng ấu trùng tử vong 1 (μg/mL) 10 (μg/mL) 50 (μg/mL) 100 (μg/mL) 200 (μg/mL)
PHUOC-TR-02 0 1 4 6 10
PHUOC-TR-03 2 2 5 7 10
Bảng 7: Kết quả thử nghiệm lần 2
Các loại mẫu
Số lượng ấu trùng tử vong 1 (μg/mL) 10 (μg/mL) 50 (μg/mL) 100 (μg/mL) 200 (μg/mL)
Cao ethyl acetate 0 1 3 3 5
PHUOC-TR-02 1 3 4 7 8
PHUOC-TR-03 2 2 4 5 10
Bảng 8: Kết quả thử nghiệm lần 3
Các loại mẫu
Số lượng ấu trùng tử vong 1 (μg/mL) 10 (μg/mL) 50 (μg/mL) 100 (μg/mL) 200 (μg/mL)
Cao ethyl acetate 0 1 2 3 5
PHUOC-TR-02 1 2 4 7 8
PHUOC-TR-03 2 3 5 9 10
V.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa
Các mẫu chất PHUOC-TR-01, PHUOC-TR-02, PHUOC-TR-03được chúng tôi gửi thử hoạt tính chống oxy hóa tại Phòng Sinh Học Thực Nghiệm - Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên - 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội.
Phản ứng thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa đươc tiến hành theo phương pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena, K. và CS (2003). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hòa. Khi các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này nếu chất có khả năng làm trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm.
Khả năng bẫy các gốc tự do SC% (Scavenging capacity) là giá trị trung bình của SC% ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình xử lý số liệu Exel theo công thức:
Độ lệch tiêu chuẩn σ tính theo công thức của Ducan như sau:
Các mẫu có biểu hiện họat tính (SC ≥ 50%) sẽ được thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị SC50.
Giá trị SC50 (µL/mL): Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC50 được xác định bằng chương trình table curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa bởi chất thử.
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
OD thí nghiệm - OD mẫu trắngOD chứng âm tính × 100 ] ± σ SC% = [100 -
Σ (xi –x )¯ 2
n -1 σ =