IV. Phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao thô
IV.2 Phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao PE và cao EtOAc
Trước khi chạy sắc ký cột cũng như trong suốt quá trình sắc ký cột thì phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng để kiểm tra quá trình sắc ký cột, như một công cụ để thăm dò các chất có trong cao thô và các phân đoạn, gom các phân đoạn có các vết giống nhau và kiểm tra độ sạch của các chất trong quá trình tinh chế.
Bản mỏng được dùng là bản nhôm silica gel (KG 60 F254) tráng sẵn, kích thước 20 × 20 cm, độ dày lớp hấp phụ 0,22 mm của hãng Merck, Germany.
IV.2.1 Phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao PE của rễ mắm
35 Pđ 1 Pđ 2 Sắc ký cột thường Sắc ký cột Sắc ký cột thường Cao PE Các phân đoạn khác Pđ 3
Sơ đồ 2: Phân lập các hợp chất từ cao PE rễ mắm ổi
IV.2.1.1 Tiến hành
Cao PE tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường cỡ hạt 0,040-0,063 mm. - Khối lượng cao PE: 20 g
- Khối lượng silica gel: 350 g. - Đường kính cột: 4,5 cm.
- Chiều cao lớp silica gel: 40 cm.
- Dung môi ổn định cột: petroleum ether. - Lọ hứng 100 mL.
IV.2.1.2 Kết quả
Từ cao PE (20 g) tiến hành sắc ký cột thường (Hình 10) với hệ dung môi giải ly PE và EtOAc có độ phân cực tăng dần. Kiểm tra các phân đoạn bằng TLC dùng dung dịch H2SO4 10% trong MeOH làm thuốc thử. Các phân đoạn có Rf giống nhau được gom chung và được trình bày trong Bảng 1.
Bảng 1: Kết quả chi tiết chạy cột PE Phân
đoạn Hệ dung môi Khối lượng (g) TLC
1 PE:EtOAc = 99:1 0,692 vết dầu
2 PE:EtOAc = 98:2 0,751 3 vết tạp chất và 1 vết chính màu tím phân cựchơn 3 PE:EtOAc =98:2 6,433 1 vết chính màu xanh đậm và
2 vết mờ 4 PE:EtOAc = 95:5 3,813 nhiều vết 5 PE:EtOAc = 9:1 PE:EtOAc = 7:3 1,448 nhiều vết 6 PE:EtOAc = 5:5 1,706 nhiều vết 7 PE:EtOAc = 2:8 0,889 nhiều vết 8 EtOAc = 100% 0,296 nhiều vết 9 EtOAc:MeOH = 9:1 0,107 nhiều vết 10 EtOAc:MeOH = 1:1 0,391 nhiều vết 11 MeOH = 100% 0,452 nhiều vết 12 CH3COOH 5% trong MeOH 1,111 nhiều vết
Phân đoạn 2 tiến hành sắc ký cột như sau:
− Nhồi cột bằng silica gel pha thường cỡ hạt 0,040-0,063 mm. − Khối lượng phân đoạn 2: 0,751 g
− Khối lượng silica gel: 20 g. − Đường kính cột: 1,5 cm.
− Chiều cao lớp silica gel: 21 cm.
− Dung môi ổn định cột: petroleum ether . − Lọ hứng: 10 mL.
Kiểm tra các phân đoạn bằng TLC dùng dung dịch H2SO4 10% trong MeOH làm thuốc thử. Các phân đoạn có Rf giống nhau được gom chung và được trình bày trong Bảng 2.
Hình 11: Sắc ký cột thường phân đoạn 2 Bảng 2: Kết quả chi tiết chạy cột PE phân đoạn 2
Phân đoạn Hệ dung môi Khối lượng (g) TLC
2-1 PE:EtOAc = 99:1 0,256 nhiều vết
2-2 PE:EtOAc = 98:2 0,225 1 vết tròn màu tím
Ở phân đoạn PE:EtOAc = 98:2 thu được tinh thể hình kim màu trắng đục, hiện vết màu tím có Rf = 0,43 (PE:EtOAc = 75:25) trên TLC khi dùng thuốc thử là H2SO4
10% trong MeOH. Ký hiệu hợp chất này là PHUOC-TR-01(0,225 g).
Phân đoạn 3: thấy có tinh thể, tinh chế bằng cách sắc ký cột thường với hệ dung môi giải ly PE:CHCl3 = 1:1 thu được tinh thể hình kim màu trắng, hiện một vết tròn màu xanh đen có Rf = 0,42 (PE:EtOAc = 75:25)trên TLC khi dùng thuốc thử là H2SO4
10% trong MeOH. Ký hiệu hợp chất này là PHUOC-TR-04(0,184 g).
Hình 12: TLC PHUOC-TR-04 với hệ dung môi giải ly PE:EtOAc = 75:25 nhúng trong thuốc thử là H2SO4 10% trong MeOH.