- Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
3.3.5Phương pháp miễn dịch huỳnh quang chẩn đoán PC
2. Nguyên liệu:
3.3.5Phương pháp miễn dịch huỳnh quang chẩn đoán PC
Để phát hiện chính xác sự có mặt của Circovirus trong tổ chức, mức độ tập trung của virus trong cơ quan để phục vụ cho bước phân lập virus, tôi tiến hành phương pháp miễn dịch huỳnh quang (IF).
Với phương pháp nhuộm huỳnh quang, mỗi lợn nghiên cứu sẽ chọn ra 4 mẫu cơ quan: phổi, lạch lâm ba, gan, lách, mỗi mẫu cơ quan chọn ra 2 block có cùng tổn thương đại thể để nhuộm với kháng thể gắn thuốc nhuộm huỳnh quang. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức. Phương pháp này thực hiện dựa vào sự kết hợp giữa kháng thể đặc hiệu và kháng kháng thể đã được gắn chất phát huỳnh quang với kháng nguyên cần chẩn đoán. Nếu có phức hợp kháng nguyên – kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng. Chúng tôi dùng Fluoredcent Isothiocynat: Cho màu xanh lá mạ để phát sáng.
Trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên chưa biết.
* Tiến hành
+ Lấy bệnh phẩm cần chẩn đoán, làm thành tiêu bản (gắn bệnh phẩm lên phiến kính, cố định)
+ Khử paraffin: Ngâm vào hóa chất dưới đây Xylen I 1 ngày
Xylen II 3 ngày Xylen III 3 ngày Cồn 1000C 10 phút Cồn 900C 10 phút Cồn 800C 10 phút
Rửa nước cất hai lần mỗi lần 15 giây
+ Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch EDTA-PBS có pH=8 đun sôi trong lò vi sóng đun sôi khoảng 15 phút, để nguội tự nhiên.
+ Lau khô tiêu bản và nhỏ huyết thanh không đặc hiệu BSA-PBS 5% ủ ở 370C trong 1h. Huyết thanh được rửa sạch và vùng xung quanh lát cắt được lau bằng giấy thấm.
+ Nhỏ lên lát cắt kháng thể đơn dòng đặc hiệu tỷ lệ pha loãng 1:100 với dung dịch hòa tan kháng thể (Dako, Glostrup, Denmark), đặt silde vào tủ ấm giữ ở 370C trong 1h.
+ Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS-Tween 20 (rửa nhanh). Dịch thừa xung quanh mẫu được loại bỏ bằng giấy thấm.
+ Mẫu được phủ tiếp bằng kháng kháng thể gắn với chất huỳnh quang FITC (Sigma, Aldrich, St. Louis, MO, USA) với độ pha loãng 1:100 bằng dung dịch pha loãng kháng thể (Dako, Glostrup, Denmark). Đặt slide trong tủ ấm 370C trong 1,5h.
+ Rửa tiêu bản: Hút phần thừa xung quanh mẫu bằng giấy thấm, để slide khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 10-20 phút. Gắn lá kính bằng chất gắn dính (Dako, Glostrup, Denmark).
+ Quan sát với kính hiển vi huỳnh quang (ánh sáng tia tử ngoại). Đọc kết quả
Phản ứng dương tính: Có hiện tượng phát sáng màu xanh lá mạ do sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Phản ứng âm tính thì không có hiện tượng phát sáng.
PHẦN IV