- Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
2. Nguyên liệu:
3.3.4 Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
Phương pháp làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng paraffin theo Robert (1969) và Burn (1974). Phương pháp làm tiêu bản vi thể được thực hiện theo quy trình tẩm đúc bằng paraffin, nhuộm Hematoxilin – Eosin (HE). Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
- Khử formol
+ Mục đích để rửa sạch formol.
+ Sau khi cố định bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 7-10 ngày, lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng tổ chức theo chiều dài có kích thước 4 – 5mm, cho vào các cassette, ghi tên bệnh phẩm. Sau đó, các cassette được rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ.
- Khử nước:
Bệnh phẩm sau khi khử formol thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho qua hệ thống gồm 4 lọ cồn.
Cồn 900I, 900II, 1000I, 1000II: 3h, 3h, 4h, 12h. - Khử cồn:
Lấy bệnh phẩm ra khỏi hệ thống cồn thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho vào hệ thống 3 cốc đựng xylen.
Xylen I: 4h, Xylen II 4h, Xylen III 12h. - Khử xylen:
Cho qua hệ thống 3 cốc đựng paraffin lần lượt: Paraffin I, II, III (560C): 6h, 6h, 12h.
Đúc block hay vùi thực sự
Tháo tổ chức ra khỏi xâu đặt vào ngăn chứa paraffin lỏng. Đổ paraffin lỏng vào khuôn dùng kẹp hơ nóng nhúng nhanh vào ngăn để gắp miếng tổ chức đặt vào khuôn. Dùng kẹp hay kim đầu tù đã hơ nóng để định hướng bệnh phẩm
vào chính giữa khuôn theo ý muốn. Khoảng 10 giây paraffin lỏng tiếp xúc với khuôn tạo nên một màng mỏng và khi đó bệnh phẩm đã được định hướng. Sau đó đặt khuôn đúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. Bóc khuôn, chỉnh sửa lại block cho vuông vắn và gắn nhãn tránh nhầm lẫn.
Chú ý: Không được cắt mảnh ngay, phải đợi sau 24h. Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Cắt mảnh: Cắt miếng tổ chức trên máy cắt microtom với độ dày 2-5µm. Dán mảnh: Miếng tổ chức sau khi cắt sẽ được tãi phẳng trên phiến kính nhờ cho vào bình nước ấm 500C, tiếp theo tải lát cát lên phiến kính. Sau đó để tủ ấm 370C trong 12 – 24h đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem nhuộm được.
Nhuộm tiêu bản
Nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép bằng thuốc nhuộm Hematoxilin- Eosin. Các bước nhuộm như sau:
+ Khử paraffin: Cho tiêu bản qua hệ thống gồm 3 lọ: Xylen I : 10 phút
Xylen II : 10 phút Xylen III : 10 phút
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000 : 2 lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 500 : 1 lần
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút. + Nhuộm Hematoxylin ( nhuộm nhân):
Sau khi đã rửa tiêu bản qua nước chảy trong vòng 15 phút ta đem lau khô nước xung quanh tiêu bản, đặt tiêu bản lên trên giá để rồi nhỏ Hematoxylin ngập tiêu bản, để trong vòng 5 phút. Sau đó đổ thuốc nhuộm đi, cho rửa nước chảy trong vòng 10 phút cho hết Hematoxylin thừa. Đem lau sạch nước xung quanh
tiêu bản và vẩy khô. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản có màu xanh tím là được. Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây). Nếu đậm quá thì dừng nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 600 + HCl, tỷ lệ là 1%) trong 30 giây.
+ Nhuộm Eosin ( nhuộm bào tương):
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản 5-10 phút tùy theo thực tế màu Eosin. Sau đó rửa nước chảy 10 phút cho hết Eosin thừa. Sau khi rửa nước ta lau sạch phần nước xung quanh bệnh phẩm rồi vào quy trình tẩy nước.
+ Tẩy nước: Ta cho tiêu bản qua hệ thống Cồn 900I : 15 giây
Cồn 1000I : 15 giây Cồn 1000I : 15 giây
+ Tẩy cồn làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua Xylen I. Sau đó sang Xylen II, lau sạch cồn ở xung quanh lam kính rồi chuyển sang Xylen III tiếp theo là sang Xylen IV, sau đó cho vào Xylen đã làm nóng trong tủ ấm 370C trong vòng 2 phút.
Gắn Baume Canada
Nhỏ một giọt Baume Canada, Xylen ấm lên trên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen ấm lên trên tiêu bản. Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngoài.
Đánh giá kết quả
Đem soi kính hiển vi quang học với vật kính 10X. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khí là được.