HAI LOÀI RONG S. MCCLUREI VÀ S. POLYCYSTUM
Trên cơ sở phân tích ở trên, tôi lựa chọn hai loài rong điển hình: một loài có hàm lượng fucoidan thấp nhất (S. mcclurei) và loài có hàm lượng fucoidan cao nhất (S. polycystum) để thu nhận fucoidan và sử dụng fucoidan thu được để đánh giá thành phần đường trung tính trong fucoidan. Việc đánh giá thành phần đường trung tính trong fucoidan sẽ giúp cho việc định lượng fucoidan chính xác hơn và cũng là cở sở để dự đoán hoạt tính sinh học của fucoidan.
Các dạnh đường 6 carbon trong dung dịch thường tồn tại 4 dạng đồng phân: 2 đồng phân , của vòng furano (vòng 5) và 2 đồng phân , của vòng pyrano (vòng 6). Do đó nếu ta tiến hành trực tiếp acetyl hoá để xác định bằng sắc ký khí kết quả sẽ thu được 4 pic trên sắc ký đồ cho mỗi đường.
Trong khi đó fucoidan luôn có chứa nhiều thành phần đường khác, như vậy sắc ký đồ sẽ rất phức tạp, các pic của đường này sẽ chồng chất lên pic của đường khác rất khó cho việc xác định diện tích pic. Để giải quyết vấn đề này, trước khi cetate hoá đường phải mở vòng tạo thành alditol, mỗi đường chỉ có một pic trên sắc ký đồ GC. Nếu sử dụng cột phân cực trung bình, các pic đường sẽ tách xa nhau dễ tính toán, nhưng mất rất nhiều thời gian để chạy mẫu (khoảng 1 giờ cho 1 mẫu kể cả rửa cột), do đó trong đồ án này, chúng tôi đã chạy cột không phân cực. Sắc ký đồ các đường chuẩn thể hiện ở hình 3.3 và 3.4. Kết quả thành phần đường trung tính được trình bày trong bảng 3.3.
Data:GLUCO.D01 Method:GLUCO.M01 Ch=1 Chrom:GLUCO.C01 Atten:10 500 100 0 mV
Hình 3.3. Sắc ký đồ GC của hexaacetat glucitol
Data:1MIX_SU.D01 Chrom:1MIX_SU.C01 5.5 6.0 6.5 7.0 min 50 0
10 mV xylose/5.500/146652 fucose/5.547/54007 rhamnose/5.661/61163 inositol/6.883/27966 mannose/6.948 /39439 glucose/6.994/55026 galactose/7.038/42524
Hình 3.4. Sắc ký đồ GC của các đường chuẩn
Bảng 3.3. Thành phần đường trung tính của fucoidan
Fucoidan từ các
loài rong Thành phần mol đường trung tính
Fuc Xyl Rha Man Glu Gal
S. mcclurei 1 0.05 0.5 0.24 0.08 0.11
50.51% 2.53% 25.25% 12.12% 4.04% 5.56%
S. polycystum 1 0.19 0.27 0.27 0.13 0.92
35.97% 6.83% 9.71% 9.71% 4.68% 33.09%
50.51 2.53 12.12 4.04 5.56 35.97 6.83 9.71 4.68 33.09 25.25 9.71 0 10 20 30 40 50 60 Fuc Xyl Rha Man Glu Gal Thành phần mol (%) S. mcclurei S. polycystum Đường trung tính
Hình 3.5. Sự thay đổi thành phần đường trung tính trong hai mẫu fucoidan của hai loài rong S. polycystum và S. mcclurei
Nhận xét
Từ kết quả phân tích ở bảng 3.3 và hình 3.3, 3.4, 3.5 cho thấy các đường L- Fucose, D-Xylose, D-Rhamnose, D-Mannose, D-Glucose, D-Galactose được thủy phân từ fucoidan sẽ được xác định trên cơ sở so sánh với mẫu chuẩn hình 3.3 và 3.4. Bảng 3.2 cũng cho thấy tất cả các polysacarit sunphat từ các hai loài rong mơ trên đều có tỉ lệ đáng kể L-Fucose. Trong đó fucoidan từ loài S. mcclurei có hàm lượng đường fucose lớn nhất với 50,51 %. Hàm lượng D-Galactose chiếm tỉ lệ gần bằng của L-Fucose trong loài S. polycystum. Các đường D-Xylose và D-Glucose chiếm tỉ lệ nhỏ hơn (2-6 %) so với đường D-Rhamnose và D-Mannose với khoảng 9-25%. Hàm lượng đường D-Xylose ở loài S. polycystum (6.83 %) lớn hơn ở loài S. mcclurei (2.53%). Đường D-Rhamnose ở S. mcclurei (25.25%) lớn hơn ở loài S. polycystum (9.71%). Đường D-Mannose ở loài S. mcclurei (12.12 %) lớn hơn ở loài
S. polycystum (9.71%). Hàm lượng đường D-Glucose dao động không nhiều ở hai loài rong, S. mcclurei (4.04%) và S. polycystum (4.68%). Như vậy, thành phần đường có bốn loại đường chính với tỉ lệ khác nhau, trong đó đường fucose chiếm ưu thế. Cũng chính vì đặc điểm này mà việc xác định đặc điểm cấu trúc fucoidan từ rong mơ Sargassum khá phức tạp. Thực tế, thành phần của rong đỏ cũng chứa các đường khác và glucuronic axít như rong nâu [15], [16]. Rong lục cũng có chứa Galactan sulfat cùng với các đường khác, nhưng cho đến nay các tác giả nghiên cứu cấu trúc agar cũng chỉ xét Galactose là chủ yếu như fucoidan trước đây chỉ xét có fucose. Việc xác định cấu trúc fucoidan với các thành phần đường khác nhau của một số tác giả trong những năm gần đây có thể sẽ mở đầu cho việc xác định chính xác hơn cấu trúc agar trong thời gian tới.
Ngoài phương pháp xác định hàm lượng fucoidan trong rong nâu bằng cách tách chiết fucoidan rồi sấy đến khối lượng không đổi, người ta còn dùng phương pháp xác định hàm lượng fucoidan thông qua hàm lượng fucose. Với fucoidan từ rong nâu vùng
ôn đới (thường chỉ có vài loài rong và phổ biến là một loài, ví dụ như Laminaria japonica, Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus…) thành phần của fucoidan từ chúng hầu như chỉ có đường fucose, các loại đường khác hàm lượng rất thấp, có thể coi như bỏ qua, vì vậy người ta thường xác định fucoidan bằng cách xác định hàm lượng fucose sau đó nhân với hệ số 1.5 hay 1.8 tùy theo fucoidan từ loài rong nào.
Tuy nhiên từ kết quả của thí nghiệm phân tích thành phần đường trung tính có trong fucoidan, ta có thể thấy được hàm lượng các loại đường khác ngoài fucose cũng rất lớn. Chẳng hạn như, trong loài S. polycystum thì hàm lượng D-Galactose và L-Fucose gần xấp xỉ tương đương nhau, cụ thể DGalactose chiếm 33.09% và L- Fucose chiếm 35.97%. Chính vì thế, không nên nhân hệ số nào cho fucose để xác định hàm lượng fucoidan.
Từ kết quả phân tích ở trên cho thấy phương pháp đơn giản nhất (chấp nhận một sự mất mát nhỏ bằng một chuỗi phản ứng xảy ra hoàn toàn (tạo kết tủa)) đó là hàm lượng fucoidan được tính bằng lượng fucoidan tinh chế đã sấy khô so với lượng mẫu rong khô đã sử dụng. Do vậy, đồ án đã sử dụng kĩ thuật này để đánh giá hàm lượng fucoidan.