Nguyên lí của phương pháp này là tách chiết fucoidan ra khỏi rong Nâu, rồi thủy phân fucoidan thành đường bằng inositol, TFA. Dùng thiết bị sắc kí khí GC – 17A Shimadzu FID với cột không phân cực để xác định thành phần và hàm lượng đường trong mẫu.
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp sắc ký là dựa vào sự khác biệt của ái lực của các cấu tử trong hỗn hợp chất cần phần tích với pha động và pha tĩnh. Pha động là chất khí có tác dụng lôi kéo các chất cần tách di chuyển trong cột sắc ký có chứa pha tĩnh. Pha tĩnh là chất lỏng nhớt được phủ trên bề mặt bên trong của cột mao quản hoặc là những hạt chất rắn nhỏ được nhồi vào cột có tác dụng giữ chất ở lại. Để tách được các chất từ một hỗn hợp cần có sự tác động của cả pha tĩnh và pha động. Sự tác động này đối với từng cấu tử khác nhau là khác nhau. Vì vậy khi cho hỗn hợp chất cần phân tích đi qua bề mặt pha tĩnh thì các cấu tử sẽ bị tách khỏi nhau, từ đó có thể định tính cũng như định lượng chúng.
Định tính thành phần đường trong fucoidan bằng cách só sánh thời gian lưu của chất phân tích với chất chuẩn.
Mỗi chất được xác định bằng píc trên sắc ký đồ, qua hệ thống phân tích xử lý số liệu, các peak sẽ được tính diện tích, chiều cao. Dựa vào các số liệu đó ta có thể tính toán được hàm lượng của mỗi chất.
Hình 2 .4 . Quy trình xác đ ịnh th
ành ph ần đ ư ờ ng trung tính trong L
ọc nhựa trao đổi ion d ương R ửa, loại bỏ tạp chất Ngâm L ọc vải Xay L ọc cát v à than ho ạt tính 2 lần Rong khô T
ủa Fucoidan bằng nhựa Benzalkonium chloride
R ửa giải
Rong khô/nư ớc: 1/8
Th ời gian 2h : H 2 O 2 /rong khô: 1/40 CaCl 2 /rong khô: 1/10 Th ời gian: 45’ D ịch Bã Xác đ ịnh th ành ph ần đ ư ờng trong fucoidan
fucoidan của rong Nâu Thuyết minh quy trình
Rửa và loại bỏ tạp chất
Lấy một khối lượng rong biển đem rửa vài lần trong nước máy. Trong quá trình rửa loại bỏ tạp chất như cát, sạn, san hô chết… và các loại rong tạp.
Ngâm
Rong biển sau khi rửa được cho vào ngâm trong nước máy trong thời gian 1 giờ. Sau đó, ta đổ lượng nước ngâm này đi. Mục đích của quá trình ngâm này là làm hòa tan muối biển vào trong nước ngâm. Như chúng ta đã biết, hàm lượng muối cao sẽ gây cản trở và làm hòa tan trở lại tủa fucoidan. Chính vì thế, để đơn giản quá trình tinh sạch Fucoidan cần loại bỏ bớt hàm lượng muối qua công đoạn này.
Sau khi ngâm rong 1 giờ trong nước máy, ta tiếp tục thêm nước với tỉ lệ rong/ nước là 1/8; đồng thời bổ sung thêm dung dịch NaOH 30% với tỉ lệ NaOH/rong là 1/20. Bổ sung NaOH vào trong lúc ngâm rong với mục đích làm mềm rong, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xay. Đồng thời, kiềm còn có tác dụng phá vỡ cấu trúc tế bào rong biển, tạo thuận lợi cho việc giải phóng các chất cần thiết.
Xay
Nâng nhiệt độ của hỗn hợp rong và nước lên 700C trước khi tiến hành xay. Vì ở nhiệt độ trên 700C thì các polysaccharide mới có thể giải phóng triệt để.
Xay rong bằng máy xay có lưỡi dao cắt chuyển động xoay quanh trục cố định. Thời gian xay là 45 phút. Trong 45 phút xay rong, ta bổ sung dung dịch H2O2 với tỉ lệ H2O2/rong là 1/40. H2O2 là một chất oxi hóa mạnh. Bổ sung H2O2 vào trong quá trình xay với mục đích là tẩy màu dịch rong. Trong quá trình xay ta cũng đồng thời tủa alginate. Vì alginate kết tủa với canxi trong điều kiện trung tính, nên ta cần trung hòa hỗn hợp rong xay trước khi cho CaCl2 với tỉ lệ CaCl2/rong là 1/10 vào thùng xay.
Lọc vải
Hỗn hợp rong sau khi xay được đem lọc qua vải, thu phần dịch, bỏ bã. Quá trình lọc qua vải còn loại bỏ một phần tủa alginate. Tủa alginate sẽ theo phần bã được loại
bỏ đi. Tuy nhiên quá trình lọc vải không thể loại bỏ hoàn toàn tủa alginate và bã rong. Trong dịch rong vẫn còn chứa các chất rắn lơ lửng và các tủa alginate mịn. Chính vì thế, dịch rong cần được lọc qua cột cát và than hoạt tính.
Lọc cát và than hoạt tính
Dịch rong sau khi lọc vải được lọc qua cột cát và than hoạt tính hai lần. Quá trình lọc này giúp loại bỏ các tủa alginate mịn và các chất rắn nhỏ lơ lửng trong dịch. Sau khi lọc một thời gian, cột cát và than hoạt tính bị tắt nghẽn; ta cần phải rửa sạch cát và than hoạt tính trước khi tiến hành lọc tiếp.
Lọc nhựa trao đổi ion dương
Dịch rong được lọc qua cột nhựa trao đổi ion dương để loại bỏ muối trong dung dịch. Do các hạt nhựa trao đổi ion dương có chứa các gốc âm, có khả năng liên kết với các ion dương như Ca2+ do muối điện li, nên giữ chúng trên bề mặt hạt nhựa.
Tủa fucoidan
Dịch rong sau khi lọc qua nhựa trao đổi ion dương được đem tủa bằng nhựa benzalkonium chloride đến tủa hoàn toàn. Dùng gậy sạch khuấy đều dung dịch, rồi tiến hành để lắng trong 24h. Sau thời gian để lắng, tủa fucoidan – benzalkonium chloride được lọc qua vải lọc thô. Rửa sạch kết tủa bằng nước cất, các chất khác như 1-3beta gulucan..polyphenol sẽ tan trong dịch và
bị loại. Rửa giải
Muối sẽ được đưa vào để rửa giải fucoidan tan ra dung dịch. Tuy nhiên, đưa nước vào sẽ làm kết tủa lơ lửng, nhầy rất khó thu nhận.
EtOH có tác dụng kết tủa fucoidan, muối được trộn trong EtOH sẽ đẩy fucoidan ra, nhựa lỏng tan vào EtOH và EtOH làm kết tủa fucoidan không có nhựa, tức là kết tủa fucoidan - nhựa lỏng sẽ trở thành kết tủa fucoidan trong EtOH, còn nhựa tan vào dịch EtOH và muối.
Rửa kết tủa nhiều lần bằng EtOH 85% (v/v) để hòa tan hết muối và nhựa lỏng còn dính trong fucoidan (nếu rửa bằng ethanol tuyệt đối thì muối sẽ kết tủa theo
fucoidan chứ không tan ra dung dịch). Lần cuối cùng dùng EtOH tuyệt đối hoặc aceton để rửa, nước bị hút hết vào EtOH, fucoidan được đem sấy khô thu được fucoidan tinh sạch.
Phân tích thành phần đường của fucoidan sạch:
Mẫu fucoidan khô (0.2 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm vào 0.02mg inositol, 0.3 ml TFA 2M, thuỷ phân trong 2h ở 120oC. Cho bay hơi đến khô trong dòng khí ở nhiệt độ 40oC rồi thêm 0.5 ml MeOH cho bay hơi, lặp lại hai lần.
Cho vào trong ống nghiệm, có chứa sản phẩm fucoidan đã thuỷ phân, 0.3ml NaBH4 0.25M vừa pha xong trong NH4OH 1M rồi để yên 30 phút ở 20oC. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 0.5ml axetic axít 10% trong metanol, cho bay hơi đến khô, lặp lại lần nữa. Cho vào ống nghiệm 0.5 ml MeOH, bay hơi đến khô, lặp lại hai lần.
Axetyl hoá các gốc đường bằng 0.2ml dung dịch Ac2O:pyridin = 1:1(v/v) ở 100oC trong 20 phút. Cho bay hơi hỗn hợp phản ứng, thêm vào 0.5ml toluen, cho bay hơi đến khô, lặp lại hai lần. Chiết sản phẩm đã axetyl hoá bằng etyl axetat.
Mẫu được xác định thành phần đường bằng sắc ký khí trên máy sắc kí khí GC- 17A Shimadzu.
Các đường chuẩn fuc, rha, xyl, man, glc, gal được xử lý tương tự như xử lý mẫu.