liệu rong S. polycystum
Tiến hành 4 mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu 50 g rong S. polycystum để nghiên cứu thu nhận fucoidan bằng một số phương pháp chiết khác nhau: mẫu 1 chiết rút fucoidan ra khỏi rong nâu trong dung dịch CaCl2 có gia nhiệt ở nhiệt độ 900C theo quy trình 1, mẫu 2 chiết rút fucoidan ra khỏi rong nâu trong môi trường nước nóng theo quy trình 2, mẫu 3 chiết rút fucoidan ra khỏi rong nâu trong môi trường axit HCl pH =2 ở nhiệt độ 1000C theo quy trình 3, mẫu 4 chiết rút fucoidan ra khỏi rong nâu trong môi trường axit HCl 0.1N ở nhiệt độ thư ờng theo quy tr ình 4. H ình 2.8. S ơ đ ồ bố trí thí nghiệm xác đ ịnh điều kiện chi ết rút fu
coidan ra So sánh hàm lư ợng fucoid an B ột rong S. polycystum Quy trình 1 Quy trình 2 Quy trình 3 Quy trình 4 Cân Tính hàm lư ợng
fucoidan trong rong khô
khỏi rong S. polycystum
Thuyết minh quy trình
Bột rong loài S. polycystum được đem tiến hành bố trí thí nghiệm theo quy trình 1, quy trình 2, quy trình 3 và quy trình 4 dã trình bày tại mục 2.3.1 để thu fucoidan.
Fucoidan thu được từ 4 quy trình khác nhau sẽ được đem cân trên cân tiểu li, từ khối lượng fucoidan thu được ta tính được hàm lượng fucoidan có trong mẫu rong ban đầu đem tiến hành thí nghiệm.
So sánh hàm lượng fucoidan thu được khi tiến hành chiết rút từ 4 quy trình khác nhau ở những điều kiện chiết rút khác nhau để tìm ra được điều kiện chiết rút fucoidan hiệu quả nhất.
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, kết quả là trung bình chung giữa các lần thí nghiệm. Sử dụng phần mềm Microsoff Excel 2007 để xử lí số liệu và vẽ đồ thị.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG FUCOIDAN THU NHẬN TỪ RONG S.
SERRATUM BẰNG BA PHƯƠNG PHÁP KHÁC NHAU
Hiện nay có một số quy trình thu nhận fucoidan với kĩ thuật khác nhau như quy trình theo bản quyền US6573250B2, bản quyền EP0645143A1 (tách fucoidan bằng nước và tách fucodian trong dung dịch HCl pH=2), quy trình tách chiết fucoidan của Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự. Do vậy để lựa chọn được quy trình có hiệu suất thu nhận fucoidan cao, tôi tiến hành 4 mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu thí nghiệm sử dụng 50g bột rong khô loài S. serratum để thu nhận fucoidan. Các mẫu thí nghiệm đều lặp lại 3 lần, kết quả là trung bình chung giữa các lần thí nghiệm. Sau khi thu nhận fucoidan tiến hành sấy khô đến trọng lượng không đổi và cân định lượng hàm lượng fucoidan. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng fucoidan chiết tách bằng các phương pháp khác nhau (% so với khối lượng rong khô)
Phương pháp Hàm lượng fucoidan (% so với khối lượng rong khô)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Quy trình 1 1.21 1.10 1.25 1.19
Quy trình 2 2.04 2.10 2.00 2.05
Quy trình 4 1.32 1.30 1.29 1.30
Hàm lượng fucoidan tương đối (% so với cực đại)
58.05 100 72.68 63.41 0 20 40 60 80 100 120 Quy trình 1 Quy trình 2 Quy trình 3 Quy trình 4 Quy trình
Hình 3.1. Sự thay đổi hàm lượng fucoidan tách chiết được từ rong
S. serratum bằng các phương pháp khác nhau Nhận xét
Từ kết quả xác định hàm lượng fucoidan chiết tách từ rong nâu bằng các phương pháp khác nhau thể hiện trong bảng 3.1 và đồ thị 3.1, cho thấy hàm lượng fucoidan thu từ rong nâu S. serratum chiết tách bằng các phương pháp khác nhau dao động từ 1.19 % đến 2.05 % so với khối lượng rong khô. Hàm lượng fucoidan cao nhất khi tiến hành chiết tách bằng phương pháp theo quy trình 2 – sử dụng nước làm dung môi chiết và hàm lượng fucoidan thu được đạt cao nhất tới 2.05 % trọng lượng khô của rong. Hàm lượng fucoidan thu được thấp nhất khi chiết rút fucoidan bằng phương pháp tách chiết fucoidan theo quy trình 1 và hàm lượng fucoidan thu được chỉ đạt 1.19 % so với trọng lượng rong khô, nếu so sánh với hàm lượng fucoidan thu được theo quy trình 2 thì hàm lượng fucoidan chiết theo phương pháp này chỉ chiếm 58.05 %.
Một số quy trình chiết rút fucoidan có sử dụng CaCl2 để kết tủa alginate và bổ sung CaCl2 vào trước giai đoạn đun nóng. Thực thế thử nghiệm cho thấy rằng khi đun nóng bột rong trong dung dịch CaCl2 dịch chiết thu được sẽ trong và dễ lọc, dễ làm sạch, dịch chiết chỉ có chứa polysaccharide là fucoidan và laminaran do axit alginic đã bị chuyển thành alginate calcium kết tủa. Tuy nhiên khi alginate bị kết tủa trong màng tế bào làm ngăn cản quá trình khuyết tán fucoidan. Chính vì vậy, hàm lượng fucoidan thu được không cao, đồng nghĩa với hiệu suất chiết tách fucoidan của phương pháp bổ sung CaCl2 trước giai đoạn đun nóng như quy trình 1 thấp.
Hàm lượng fucoidan tách chiết được theo quy trình 4 cũng thấp và hàm lượng fucoidan thu được chỉ đạt 1,3% khối lượng rong khô, nếu so với hàm lượng fucoidan chiết tách theo quy trình 2 thì hàm lượng fucoidan chiết tách theo phương pháp này chỉ chiếm 63.41 % so với cực đại. Nguyên nhân hàm lượng fucoidan tách chiết được theo phương pháp này thấp là do trong quá trình tủa, rửa giải tủa alginate và fucoidan với nhựa benzalkonium chloride đã làm tổn thất một lượng fucoidan qua thiết bị, bởi vì muối fucoidan – benzalkonium chloride có tính bám dính cao.
Qua việc sử dụng các phương pháp tách chiết khác nhau để thu nhận fucoidan, cho thấy phương pháp tách chiết fucoidan theo quy trình 2 – sử dụng nước làm dung môi chiết - cho hàm lượng fucoidan thu từ rong cao nhất. Chính vì thế, tôi sử dụng phương pháp này để thu nhận fucoidan từ năm loài rong Nâu tại tỉnh Khánh Hòa.
3.2. KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG FUCOIDAN TRONG NĂM LOÀI RONG NÂU THU MẪU TẠI TỈNH KHÁNH HÒA NÂU THU MẪU TẠI TỈNH KHÁNH HÒA
Từ kết quả nghiên cứu ở trên, tôi sử dụng phương pháp theo quy trình 2 để chiết tách, thu nhận fucoidan từ năm loài rong Nâu S. mcclurei, S. binderi, S. microcystum, S. polycystum, S. serratum đã thu mẫu tại Khánh Hòa. Với mỗi loài rong tiến hành ba lần thí nghiệm tách chiết và kết quả là trung bình chung giữa các lần thí nghiệm. Kết quả hàm lượng fucoidan thu được trong năm loài rong Nâu được thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lượng fucoidan trong năm loài rong Nâu tại tỉnh Khánh Hòa (% so với trọng lượng rong khô)
Loài Hàm lượng fucoidan (% so với trọng lượng rong khô)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình S. mcclurei 1.33 1.34 1.34 1.34 S. binderi 2.94 2.93 2.95 2.94 S. microcystum 3.33 3.34 3.35 3.34 S. polycystum 3.56 3.53 3.54 3.54 S. serratum 2.04 2.04 2.04 2.04 37.85 83.05
100 57.63 0 20 40 60 80 100 120 S. mcclurei S. binderi S. microcystum S. polycystum S. serratum
Hàm lượng fucoidan tương đối (% so với cực đại)
Loài rong
Hình 3.2. Sự thay đổi hàm lượng fucoidan trong năm loài rong nâu thu mẫu tại tỉnh Khánh Hòa
Nhận xét
Từ kết quả thu nhận fucoidan từ năm loài rong Nâu thu mẫu tại tỉnh Khánh Hòa được trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.2, cho thấy hàm lượng fucoidan thu được ở các loài rong khác nhau cũng khác nhau và dao động trong khoảng 1.3 đến 3.5 % trọng lượng chất khô của rong. Trong đó hàm lượng fucoidan trong loài rong
S. mcclurei là thấp nhất trong năm loài rong và chiếm 37.85 % so với hàm lượng fucodian cực đại thu từ loài rong S. polycystum. Hàm lượng fucoidan trong loài S. polycystum là cao nhất trong năm loài rong tiến hành thí nghiệm và chiếm 3.54 % trọng lượng rong khô. Từ kết quả trên, ta có thể thấy rong S. polycystum là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho quá trình sản xuất fucoidan.
Bên cạnh đó, hàm lượng fucoidan trong loài S. microcystum và loài S. binderi
cũng cao gần tương đương với loài rong S. polycystum và chiếm tương ứng là 94.35 % và 83.05% so với cực đại. Chính vì thế, ngoài nguồn nguyên liệu là loài S. polycystum thì loài S. microcystum và S. binderi cũng là nguồn rong Nâu có giá trị kinh tế cao cần được chú trọng thu nhận trong công nghiệp sản xuất fucoidan.
3.3. SƠ BỘ ĐÁNH GIÁ THÀNH PHẦN ĐƯỜNG TRUNG TÍNH TRONG HAI LOÀI RONG S. MCCLUREI VÀ S. POLYCYSTUM HAI LOÀI RONG S. MCCLUREI VÀ S. POLYCYSTUM
Trên cơ sở phân tích ở trên, tôi lựa chọn hai loài rong điển hình: một loài có hàm lượng fucoidan thấp nhất (S. mcclurei) và loài có hàm lượng fucoidan cao nhất (S. polycystum) để thu nhận fucoidan và sử dụng fucoidan thu được để đánh giá thành phần đường trung tính trong fucoidan. Việc đánh giá thành phần đường trung tính trong fucoidan sẽ giúp cho việc định lượng fucoidan chính xác hơn và cũng là cở sở để dự đoán hoạt tính sinh học của fucoidan.
Các dạnh đường 6 carbon trong dung dịch thường tồn tại 4 dạng đồng phân: 2 đồng phân , của vòng furano (vòng 5) và 2 đồng phân , của vòng pyrano (vòng 6). Do đó nếu ta tiến hành trực tiếp acetyl hoá để xác định bằng sắc ký khí kết quả sẽ thu được 4 pic trên sắc ký đồ cho mỗi đường.
Trong khi đó fucoidan luôn có chứa nhiều thành phần đường khác, như vậy sắc ký đồ sẽ rất phức tạp, các pic của đường này sẽ chồng chất lên pic của đường khác rất khó cho việc xác định diện tích pic. Để giải quyết vấn đề này, trước khi cetate hoá đường phải mở vòng tạo thành alditol, mỗi đường chỉ có một pic trên sắc ký đồ GC. Nếu sử dụng cột phân cực trung bình, các pic đường sẽ tách xa nhau dễ tính toán, nhưng mất rất nhiều thời gian để chạy mẫu (khoảng 1 giờ cho 1 mẫu kể cả rửa cột), do đó trong đồ án này, chúng tôi đã chạy cột không phân cực. Sắc ký đồ các đường chuẩn thể hiện ở hình 3.3 và 3.4. Kết quả thành phần đường trung tính được trình bày trong bảng 3.3.
Data:GLUCO.D01 Method:GLUCO.M01 Ch=1 Chrom:GLUCO.C01 Atten:10 500 100 0 mV
Hình 3.3. Sắc ký đồ GC của hexaacetat glucitol
Data:1MIX_SU.D01 Chrom:1MIX_SU.C01 5.5 6.0 6.5 7.0 min 50 0
10 mV xylose/5.500/146652 fucose/5.547/54007 rhamnose/5.661/61163 inositol/6.883/27966 mannose/6.948 /39439 glucose/6.994/55026 galactose/7.038/42524
Hình 3.4. Sắc ký đồ GC của các đường chuẩn
Bảng 3.3. Thành phần đường trung tính của fucoidan
Fucoidan từ các
loài rong Thành phần mol đường trung tính
Fuc Xyl Rha Man Glu Gal
S. mcclurei 1 0.05 0.5 0.24 0.08 0.11
50.51% 2.53% 25.25% 12.12% 4.04% 5.56%
S. polycystum 1 0.19 0.27 0.27 0.13 0.92
35.97% 6.83% 9.71% 9.71% 4.68% 33.09%
50.51 2.53 12.12 4.04 5.56 35.97 6.83 9.71 4.68 33.09 25.25 9.71 0 10 20 30 40 50 60 Fuc Xyl Rha Man Glu Gal Thành phần mol (%) S. mcclurei S. polycystum Đường trung tính
Hình 3.5. Sự thay đổi thành phần đường trung tính trong hai mẫu fucoidan của hai loài rong S. polycystum và S. mcclurei
Nhận xét
Từ kết quả phân tích ở bảng 3.3 và hình 3.3, 3.4, 3.5 cho thấy các đường L- Fucose, D-Xylose, D-Rhamnose, D-Mannose, D-Glucose, D-Galactose được thủy phân từ fucoidan sẽ được xác định trên cơ sở so sánh với mẫu chuẩn hình 3.3 và 3.4. Bảng 3.2 cũng cho thấy tất cả các polysacarit sunphat từ các hai loài rong mơ trên đều có tỉ lệ đáng kể L-Fucose. Trong đó fucoidan từ loài S. mcclurei có hàm lượng đường fucose lớn nhất với 50,51 %. Hàm lượng D-Galactose chiếm tỉ lệ gần bằng của L-Fucose trong loài S. polycystum. Các đường D-Xylose và D-Glucose chiếm tỉ lệ nhỏ hơn (2-6 %) so với đường D-Rhamnose và D-Mannose với khoảng 9-25%. Hàm lượng đường D-Xylose ở loài S. polycystum (6.83 %) lớn hơn ở loài S. mcclurei (2.53%). Đường D-Rhamnose ở S. mcclurei (25.25%) lớn hơn ở loài S. polycystum (9.71%). Đường D-Mannose ở loài S. mcclurei (12.12 %) lớn hơn ở loài
S. polycystum (9.71%). Hàm lượng đường D-Glucose dao động không nhiều ở hai loài rong, S. mcclurei (4.04%) và S. polycystum (4.68%). Như vậy, thành phần đường có bốn loại đường chính với tỉ lệ khác nhau, trong đó đường fucose chiếm ưu thế. Cũng chính vì đặc điểm này mà việc xác định đặc điểm cấu trúc fucoidan từ rong mơ Sargassum khá phức tạp. Thực tế, thành phần của rong đỏ cũng chứa các đường khác và glucuronic axít như rong nâu [15], [16]. Rong lục cũng có chứa Galactan sulfat cùng với các đường khác, nhưng cho đến nay các tác giả nghiên cứu cấu trúc agar cũng chỉ xét Galactose là chủ yếu như fucoidan trước đây chỉ xét có fucose. Việc xác định cấu trúc fucoidan với các thành phần đường khác nhau của một số tác giả trong những năm gần đây có thể sẽ mở đầu cho việc xác định chính xác hơn cấu trúc agar trong thời gian tới.
Ngoài phương pháp xác định hàm lượng fucoidan trong rong nâu bằng cách tách chiết fucoidan rồi sấy đến khối lượng không đổi, người ta còn dùng phương pháp xác định hàm lượng fucoidan thông qua hàm lượng fucose. Với fucoidan từ rong nâu vùng
ôn đới (thường chỉ có vài loài rong và phổ biến là một loài, ví dụ như Laminaria japonica, Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus…) thành phần của fucoidan từ chúng hầu như chỉ có đường fucose, các loại đường khác hàm lượng rất thấp, có thể coi như bỏ qua, vì vậy người ta thường xác định fucoidan bằng cách xác định hàm lượng fucose sau đó nhân với hệ số 1.5 hay 1.8 tùy theo fucoidan từ loài rong nào.
Tuy nhiên từ kết quả của thí nghiệm phân tích thành phần đường trung tính có trong fucoidan, ta có thể thấy được hàm lượng các loại đường khác ngoài fucose cũng rất lớn. Chẳng hạn như, trong loài S. polycystum thì hàm lượng D-Galactose và L-Fucose gần xấp xỉ tương đương nhau, cụ thể DGalactose chiếm 33.09% và L- Fucose chiếm 35.97%. Chính vì thế, không nên nhân hệ số nào cho fucose để xác định hàm lượng fucoidan.
Từ kết quả phân tích ở trên cho thấy phương pháp đơn giản nhất (chấp nhận một sự mất mát nhỏ bằng một chuỗi phản ứng xảy ra hoàn toàn (tạo kết tủa)) đó là hàm lượng fucoidan được tính bằng lượng fucoidan tinh chế đã sấy khô so với lượng mẫu rong khô đã sử dụng. Do vậy, đồ án đã sử dụng kĩ thuật này để đánh giá hàm lượng fucoidan.
3.4. SƠ BỘ XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT TINH SẠCH FUCOIDAN TỪ LOÀI RONG S. POLYCYSTUM FUCOIDAN TỪ LOÀI RONG S. POLYCYSTUM
Hiện có nhiều phương pháp thu nhận fucoidan từ rong nâu. Tuy vậy mỗi phương pháp đều có những hạn chế nhất định. Để có thể có một quy trình thu nhận fucoidan phù hợp với rong S. polycystum, tôi tiến hành nghiên cứu xác định một số thông số tối ưu cho quá trình thu nhận fucoidan từ loài rong S. polycystum như sau :
Xác định điều kiện chiết rút fucoidan ra khỏi nguyên liệu rong S. polycystum : Tiến hành 4 mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu 50 g rong S. polycystum để nghiên cứu thu nhận fucoidan bằng một số phương pháp chiết khác nhau : mẫu 1 chiết rút fucoidan ra khỏi rong nâu trong dung dịch CaCl2 có gia nhiệt ở nhiệt độ 900C, mẫu 1 chiết rút fucoidan ra khỏi rong nâu trong môi trường nước nóng, mẫu 3 chiết rút
fucoidan ra khỏi rong nâu trong môi trường axit HCl pH =2 ở nhiệt độ 1000C, mẫu 4 chiết rút fucoidan ra khỏi rong nâu trong môi trường axit HCl 0.1N ở nhiệt độ thường. Kết quả đánh giá quá trình thu nhận thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá quá trình chiết fucoidan từ rong nâu S. polycystum
STT Mẫu thí
nghiệm Trạng thái dung dịch Hàm lượng fucoidan (% so với trọng lượng rong khô) 1 1 Dịch chiết thu được trong 2.07
2 2 Dịch chiết trong 3.54
3 3 Dịch ở trạng thái lỏng, trong 2.48 4 4 Dịch chiết thu được sánh 1.85
Nhận xét
Từ kết quả đánh giá quá trình chiết fucoidan từ rong nâu S. polycystum thể hiện trong bảng 3.4, cho thấy mẫu 1 chiết rút fucoidan trong môi trường trong dung dịch CaCl2 ở nhiệt độ 900C thì dịch chiết thu được sẽ trong và dễ lọc, dễ làm sạch, dịch chiết chỉ có chứa polysaccharide là fucoidan và laminaran. Tuy nhiên alginate bị kết tủa trong màng tế bào làm cho fucoidan không tan hết ra dịch chiết gây tổn thất một lượng fucoidan nên hàm lượng fucoidan thu được thấp, chỉ đạt 2.07 % so với trong lượng rong khô.
Mẫu 2 – chiết rút fucoidan trong môi trường nước nóng cho kết quả hàm lượng