Chúng tôi tiến hành phân lập theo quy trình MLG 4. 04 của USDA [34]. Đây là phương pháp mô tả phân tích nhiều loại thịt, sản phẩm thịt, các mẫu trứng, sản phẩm trứng để phát hiện Salmonella. Phương pháp này được khuyến cáo không sử dụng trong trường hợp phát hiện Salmonella Typhi và được áp dụng 100 % trong nghiên cứu này.
2.2.2.1. Thiết bị, dụng cụ
- Tủ sấy được thông gió bằng đối lưu. - Tủ ấm.
- Bể cách thủy.
- Que cấy vòng vô trùng, có đường kính 3 mm hoặc 10µl, hoặc pipet vô trùng. - pH Meter, có độ chính xác ± 0.10C đơn vị pH ở 200C hoặc 250
C. - Ống nghiệm, đĩa petri vô trùng.
- Pipet có dung tích 10 ml và 1 ml. - Túi đựng mẫu vô trùng.
- Lam kính. - Máy vortex.
2.2.2.2. Môi trường, thuốc thử
- Bộ nhuộm Gram. - Đệm pepton (BPW).
- Tetrathionate broth (Hajna) .
- Modified Rappaprt - Vassiliadis broth.
- Brilliant green sulfa agar, chứa 0.1 % sodium sulfapyridine).
- Xylose lysine Tergitol TM 4 agar hoặc Double modified lysine iron agar. - Triple sugar iron agar.
- Lysine iron agar. - Trypticase soy broth. - Trypticase soy agar.
- Thạch nghiêng dinh dưỡng.
- Canh thang dinh dưỡng, thạch bán rắn. - Kháng huyết thanh.
2.2.2.3. Pha chế môi trường
Pha chế môi trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Môi trường trước khi sử dụng được kiểm soát chất lượng theo TCVN 8128-1,2 : 2009
a. Bảo quản môi trường:
Trong mọi trường hợp, tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất về các điều kiện bảo quản, hạn sử dụng và cách bảo quản.
Đối với môi trường được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm, bảo quản môi trường trong điều kiện tránh được mọi thay đổi về thành phần môi trường, tránh ánh sáng và tránh bị khô và bảo quản ở 50C 30C, nếu cần. Với các đĩa môi trường, bảo quản không quá 2 tuần đến 4 tuần và đối với các ống hoặc lọ nhỏ thì không quá 3
tháng đến 6 tháng, trừ khi có qui định trong các tiêu chuẩn riêng hoặc các kết quả kiểm tra xác nhận thời hạn sử dụng của phòng thí nghiệm cho thấy lâu hơn.
Môi trường được bổ sung các thành phần không ổn định thì cần được sử dụng trong ngày, trừ khi có qui định trong các tiêu chuẩn riêng hoặc các kết quả kiểm tra xác nhận thời hạn sử dụng của phòng thí nghiệm cho thấy lâu hơn. Môi trường đặc có chứa các chất không ổn định và/ hoặc các chất hoạt hóa không được bảo quản với lượng lớn để làm tan chảy lại.
Thiết lập hạn sử dụng có hiệu lực cho môi trường được bảo quản. Quan sát mọi dấu hiệu của thay đổi về màu sắc, bay hơi/ khô hoặc có vi khuẩn phát triển. Các mẻ môi trường có các dấu hiệu thay đổi kể trên thì không được sử dụng.
Trước khi sử dụng hoặc làm nóng tiếp, cần hạ nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến nhiệt độ môi trường xung quanh.
b. Chuẩn bị môi trường trong phòng thử nghiệm:
Chuẩn bị chính xác môi trường nuôi cấy là một trong các bước cơ bản trong kiểm tra vi sinh vật và được chú ý đặc biệt.
Chú ý về thực hành tốt phòng thí nghiệm và các hướng dẫn của nhà sản xuất liên quan đến xử lý môi trường khô và các thành phần khác, đặc biệt các thành phần có chứa các vật liệu độc hại.
Khi môi trường được chuẩn bị từ chế phẩm khô có bán sẵn, thì tuân thủ chính xác các hướng dẫn của nhà sản xuất. Ghi lại tất cả các dữ liệu liên quan, nghĩa là khối lượng/ thể tích, pH, ngày chuẩn bị, điều kiện khử trùng, người thực hiện.
Đối với môi trường được chuẩn bị từ các thành phần riêng lẻ, thực hiện chính xác theo công thức và ghi lại tất cả mọi chi tiết và nhận biết đầy đủ (nghĩa là mã và số mẻ) của tất cả các thành phần được sử dụng.
c. Thử hiệu năng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh: - Kiểm soát chất lượng vật lý:
Chất lượng của môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào chất lượng của các thành phần cơ bản, công thức pha chế đúng, chất lượng của qui trình chuẩn bị và các điều kiện đóng gói và bảo quản thích hợp.
Việc đánh giá chất lượng môi trường nuôi cấy phải đảm bảo môi trường nuôi cấy phù hợp các chỉ tiêu sau:
+ Lượng phân phối hoặc độ dày. + Bề ngoài, màu sắc, tính đồng nhất. + Độ đông đặc. + Độ ẩm. + pH. + Khả năng đệm. + Nhiễm vi khuẩn.
Các thành phần riêng rẽ và mọi thành phần bổ sung chọn lọc hoặc thành phần dinh dưỡng phải được thực hiện qui trình đánh giá chất lượng thích hợp.
- Kiểm soát chất lượng vi sinh:
Kiểm tra một lượng sản phẩm thích hợp tùy thuộc vào cỡ của mẻ môi trường về sự nhiễm vi sinh vật bằng cách ủ trong các điều kiện thích hợp. Số lượng các mẫu thử nghiệm có thể là 1% số lượng đĩa hoặc ống từ giai đoạn kết thúc hoặc phân phối môi trường.
Đánh giá mỗi mẻ môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh, các thành phần dinh dưỡng hoặc thành phần bổ sung bởi:
+ Định lượng. + Bán định lượng. + Định tính. c. Xác định năng suất
Cấy các vi sinh vật thử nghiệm xác định vào các môi trường nuôi cấy lỏng, bán đặc và đặc, sử dụng dụng cụ thích hợp.
Năng suất phải đạt được giới hạn tối thiểu xác định.
Đối với các phương pháp định lượng, hệ số năng suất PR được xác định như sau:
Trong đó:
NS là số đếm khuẩn lạc tổng số thu được trên môi trường nuôi cấy của phép thử (thu được từ 1 hoặc nhiều đĩa).
NO là số đếm khuẩn lạc tổng số thu được trên môi trường nuôi cấy đối chứng thu được từ 1 hoặc nhiều đĩa và phải 100 CFU.
Chú ý: Hệ số năng suất của môi trường không chọn lọc ít nhất là 0,7 đối với vi sinh vật có thể phát triển dễ dàng trên môi trường đó. PR của các vi sinh vật đích trên môi trường chọn lọc ít nhất bằng 0,1.
Đối với các phương pháp bán định lượng, ghi lại kết quả trên các vùng liên tiếp của đĩa bằng kỹ thuật đo đặc điểm sinh thái để thu được chỉ số phát triển Gi, chỉ số này thay đổi theo môi trường nuôi cấy. Do đó, cần so sánh chúng với các chỉ số trước đó và/ hoặc Gi của môi trường kiểm chứng để chắc chắn rằng các dao động là không bị vượt quá. Dải dao động dự kiến đối với mỗi môi trường nuôi cấy có thể được thiết lập khi đã có đủ kinh nghiệm về phương pháp.
Các đánh giá định tính phải được thực hiện bằng mắt bằng cách chia phần các tỷ lệ sinh trưởng.
d. Tính chọn lọc
Để đánh giá tính chọn lọc, cấy dịch cấy thích hợp của các vi sinh vật thử nghiệm xác định vào môi trường nuôi cấy chọn lọc và môi trường kiểm chứng, dùng dụng cụ thích hợp. Tính chọn lọc phải đạt được các giá trị xác định.
Hệ số chọn lọc SF được tính như sau:
SF = DO - DS
Trong đó: DO là độ pha loãng cao nhất cho thấy phát triển ít nhất là 10 khuẩn lạc trên môi trường kiểm chứng.
DS là độ pha loãng thấp nhất cho thấy phát triển tương tự trên môi trường thử nghiệm.
SF, DO, DF được biểu thị bằng đơn vị log10
Đối với các phương pháp định lượng và bán định lượng, sự phát triển của các chủng không phải là đích phải bị ức chế toàn phần hoặc một phần.
e. Phương pháp sử dụng trong thử nghiệm hiệu năng môi trường nuôi cấy - Chuẩn bị dịch cấy làm việc:
Các dịch cấy làm việc phải được chuẩn bị như dịch cấy pha tĩnh thuần khiết trong canh thang không chọn lọc từ dịch cấy gốc đối chứng.
+ Dịch cấy làm việc để thử nghiệm năng suất:
Đối với các phép thử định lượng môi trường đổ đĩa về các vi sinh vật yêu cầu, thì sử dụng chất cấy chứa khoảng 102 CFU.
Đối với các phép thử bán định lượng hoặc định lượng môi trường đổ đĩa về các vi sinh vật yêu cầu thì sử dụng chất cấy chứa khoảng 103 CFU đến 104 CFU.
Đối với các phép thử năng suất môi trường lỏng, thì sử dụng chất cấy chứa khoảng 10 CFU đến 100 CFU.
+ Dịch cấy làm việc để thử nghiệm tính chọn lọc:
Đối với phép thử tính chọn lọc của môi trường nuôi cấy, thì cấy huyền phù của vi sinh vật không phải đích chứa 104
CFU đến 106 CFU lên đĩa hoặc vào ống môi trường.
- Phương pháp đối với môi trường nuôi cấy đặc: + Phương pháp đổ đĩa định lượng
Chọn một số lượng đĩa thích hợp đại diện cho từng lô môi trường cần thử nghiệm và đảm bảo bề mặt của mỗi đĩa đủ khô.
Dàn đều trên bề mặt các đĩa thử và đĩa kiểm chứng một lượng dịch cấy làm việc đã pha loãng để cho các số đếm nằm trong các giới hạn khuyến cáo.
Ủ các đĩa trong các điều kiện thích hợp.
Đếm các khuẩn lạc có mặt trên từng đĩa. Đánh giá kích thước và hình thái của khuẩn lạc.
Dựa vào thể tích dàn trên đĩa và hệ số pha loãng, có thể tính được số đếm trung bình trên môi trường.
Để diễn giải kết quả, thì hệ số năng suất PR và khi thích hợp thì hệ số chọn lọc SF cần được tính.
+ Phương pháp cấy vạch định tính
Các đĩa thạch được chuẩn bị theo cách thông thường với khoảng 15ml thạch. Sử dụng các dịch cấy làm việc ở trên.
Các vi sinh vật thử nghiệm được cấy vạch với các đường thẳng song song bằng que cấy vòng lên bề mặt của môi trường thử nghiệm. Một số vi sinh vật thử nghiệm có thể được cấy vạch trên cùng một đĩa mà không giao nhau
Thời gian ủ và nhiệt độ ủ được nêu trong các phương pháp chuẩn được sử dụng.
Đánh giá sự phát triển trên đĩa thạch sau khi ủ như sau: + 0 tương ứng với không phát triển
+ 1 tương ứng với phát triển yếu + 2 tương ứng với phát triển tốt
Các vi sinh vật đích phải bằng 2 và có vẻ bề ngoài, kích thước và hình thái của khuẩn lạc điển hình. Sự phát triển của các chủng không phải đích phải bị ức chế toàn phần hoặc một phần (0 hoặc 1).
- Phương pháp kiểm tra đối với môi trường nuôi cấy lỏng + Phương pháp ống đơn bán định lượng:
Chọn một số các ống hoặc các phần 10 ml của mỗi mẻ thử nghiệm
Cấy các vi sinh vật đích và không phải đích làm dịch cấy hỗn hợp: Cấy vào một ống canh thang thử nghiệm khoảng 10 CFU đến 100 CFU các vi sinh vật đích và cấy vào trong cùng một ống đó một lượng vi sinh vật không phải đích với nồng độ lớn hơn (> 1000 CFU) và trộn đều.
Cấy các vi sinh vật không phải đích: Cấy vào một ống nghiệm canh thang thử nghiệm một lượng vi sinh vật có số đếm cao (> 1000 CFU) trộn đều.
Thời gian ủ và nhiệt độ ủ được nêu trong các phương pháp chuẩn được sử dụng.
Lấy 10 l từ dịch cấy hỗn hợp và cấy vạch lên đĩa đựng môi trường chọn lọc cụ thể đối với vi sinh vật đích.
Từ dịch cấy vi sinh vật không phải đích, cấy vạch lên đĩa đựng môi trường không chọn lọc (thạch Trypton soy)
Ủ cả hai đĩa theo các điều kiện về thời gian và nhiệt độ thích hợp như trong các tiêu chuẩn riêng lẻ.
Năng suất của canh thang thử nghiệm lỏng được thỏa mãn nếu không có khuẩn lạc nào hoặc ít hơn 10 khuẩn lạc của vi sinh vật đích có phát triển trên đĩa thạch chọn lọc.
Tính chọn lọc của canh thang thử nghiệm lỏng được thỏa mãn nếu không có khuẩn lạc nào của các vi sinh vật không phải đích xuất hiện trên đĩa thạch không chọn lọc.
+ Phương pháp ống đơn định tính
Để thử nghiệm hiệu năng môi trường nuôi cấy lỏng thì dùng vòng cấy, cấy các dịch cấy làm việc trực tiếp vào môi trường này.
Thời gian ủ và nhiệt độ ủ được nêu trong các phương pháp chuẩn được sử dụng.
Việc đánh giá định tính phải được thực hiện bằng trực quan dùng các điểm ghi sự phát triển, Ví dụ: từ 0 đến 2:
0 tương ứng với không đục 1 tương ứng với hơi đục 2 tương ứng với khá đục
Các vi sinh vật đích phải bằng 2
Đôi khi sự sinh trưởng của các vi sinh vật chỉ có thể quan sát được khi sự tập trung tế bào/ lắng đọng trên đáy ống hoặc chai. Các đặc trưng khác như sinh khí, đổi màu...,cũng có thể được đánh giá bằng phương pháp này.
- Đối chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922
2.2.2.5. Các bước tiến hành
Hình 2.2. Qui trình phân lập Salmonella
Bước 1
Bước 2
Bước 3
Bước 4
Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc
- Rót 400 ml đệm pepton pH 7 vào túi đựng mẫu gà, lắc đều trong 1 phút, hút 30 ml dung dịch này vào bình chứa sẵn 30 ml đệm pepton để yên trong 30 phút, sau đó ủ ở nhiệt độ 350
C ± 20C trong 20h. Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
- Từ dịch tăng sinh sau khi ủ ở nhiệt độ 350C trong 20h ở bước 1, chuyển 0.5 ± 0.05 ml sang 10 ml Tetrathionate broth và 0.1 ± 0.02 ml sang 10 ml Modified Rapport – Vassiliadis broth.
- Ủ ở 42 ± 0.50C trong 22 -24 h hoặc trong bể cách thủy ở 42 ± 0.50C trong 18 – 24 h.
Bước 3: Phân lập từ các khuẩn lạc điển hình
a b
Hình 2.3. Khuẩn lạc Salmonella trên thạch Xylose lysine Tergitol 4 (a) và thạch Brilliant green sulfa (b)
- Từ dịch tăng sinh chọn lọc ở bước 2, sử dụng que cấy vô trùng ria lên bề mặt thạch Xylose lysine Tergitol 4 agar và Brilliant green sulfa agar.
- Ủ ở 35 ± 20C.
- Kiểm tra kết quả sau 18 – 24 h. Chọn lọc các khuẩn lạc điển hình.
+ Khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch Xylose lysine Tergitol 4 (a): màu đen hoặc đỏ, hoặc không có tâm đen, có thể chuyển sang màu vàng trong 24 h nhưng
+ Khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch Brilliant green sulfa (b): có màu hồng, bao quanh tâm hồng là viền màu đỏ, bề mặt nhẵn.
- Với những đĩa có khuẩn lạc nghi ngờ hoặc chưa mọc khuẩn lạc ủ tiếp 24 h rồi kiểm tra lại kết quả.
Bước 4: Khẳng định bằng phản ứng sinh vật hóa học
- Từ mỗi đĩa chọn ra tối thiểu 3 khuẩn lạc điển hình để thử tính chất sinh vật hóa học. Khi cả ba khuẩn lạc phải cho kết quả âm tính trong các phản ứng sinh hóa thì mới được kết luận một mẫu là âm tính Salmonella. Chú ý khi lấy khuẩn lạc, chỉ lấy ở bề mặt và tâm của khuẩn lạc, không được lấy phần thạch nuôi cấy.
- Nếu cả ba khuẩn lạc đều không tách biệt riêng rẽ trên môi trường nuôi cấy thì cần phải cấy khuẩn lạc sang một môi trường thạch chọn lọc khác, hoặc cấy khuẩn lạc vào môi trường canh thang tăng sinh chọn lọc Tetrathionate broth hoặc Modified Rapport – Vassiliadis broth và ủ qua đêm, sau đó ria lên môi trường thạch chọn lọc để có được những khuẩn lạc riêng rẽ.
- Ria lên các môi trường thạch nghiêng sàng lọc Lysine iron agar, Thạch Triple sugar. Đối với môi trường thạch thạch Triple sugar, ria từ mặt nghiêng xuống ½ đáy thạch, còn đối với môi trường thạch thạch Lysine iron, bắt đầu ria từ đáy thạch hai lần rồi kéo que ria lên trên mặt nghiêng của thạch.
- Ủ ở 35 ± 20C, trong 24 ± h.
- Sau khi ủ, kiểm tra tính chất hóa sinh thể hiện trên hai loại thạch.
- Màu đen xuất hiện ở đáy thạch là do sinh H2S và sự xuất hiện của khí H2S có thể làm nứt thạch.
- Trên thạch Triple sugar có các tính chất điển hình của Salmonella:
+ Cấy đâm sâu: Màu vàng (glucoza dương tính), màu đỏ hoặc không đổi màu