Chuẩn bị dịch pha loãng và môi trƣờng đĩa thạch. Nấu từng loại môi trƣờng thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật. Hòa tan môi trƣờng rồi phân phối vào các lọ, khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở 121oC trong 15 phút. Lấy 1mL mẫu với tỷ lệ pha loãng nhất định cho vào các hộp đĩa thạch đã đƣợc khử trùng, mỗi mức pha loãng dùng 4 đĩa thạch. Sau đấy rót vào mỗi hộp đĩa khoảng 10 mL môi trƣờng thạch sau khử trùng và để nguội ở 40-50oC. Đậy nắp và xoay tròn mỗi hộp trên mặt tủ cấy, để nguội đến khi mặt thạch đông lại, ghi số mẫu và nồng độ pha loãng lên mỗi đáy hộp petri và bọc giấy báo rồi đem nuôi ở 35oC và đọc kết quả sau 48h ± 3.
29 2.2.2.1.3.Tổng vi sinh vật hiếu khí
Sử dụng môi trƣờng R2A agar, hòa tan với lƣợng 15,2g/1000 mL, tiếp theo đem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
Lấy 1 mL mẫu hoặc mẫu đã pha loãng cho vào hộp petri đã đƣợc khử trùng, rót vào khoảng 10 mL môi trƣờng R2A agar đã khử trùng, đậy nắp và xoay tròn đều mỗi hộp trên mặt tủ cấy, để nguội, đợi khi mặt thạch đông lại hoàn toàn sau đấy ghi tên mẫu và nồng độ pha loãng lên đáy hộp petri, bao giấy rồi đem nuôi ở 35oC trong vòng 48h ± 3. Khi đủ thời gian, đem ra đọc kết quả bằng cách đếm các khuẩn lạc trên đĩa thạch. Sau đấy báo cáo số khuẩn lạc trên một đơn vị thể tích mẫu tƣơng ứng.
2.2.2.2. Phương pháp xác định độ sạch bằng ATP quang sinh
Để nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp kiểm tra nhanh vệ sinh trong dây chuyền sản xuất bia bằng đo ATP quang sinh, các bƣớc cần phải tiến hành nhƣ sau:
- Nhận dạng các điểm kiểm tra: Các điểm kiểm tra đƣợc coi là các điểm kiểm soát tới hạn (CCP), đại diện cho hiệu quả của quá trình vệ sinh. Kết quả thu đƣợc sẽ phản ánh thực tế hiệu quả của quá trình vệ sinh.
Các điểm kiểm tra nói chung đƣợc chia làm hai nhóm:
Bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm và nhóm bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm.
- Lập kế hoạch lấy mẫu: Căn cứ sơ đồ sản xuất, xây dựng kế hoạch lấy mẫu, tần suất lấy mẫu cho phù hợp từng vị trí kiểm tra.
- Thu thập dữ liệu và xây dựng giới hạn thƣờng quy: Nội dung này giúp nhận diện tình trạng vệ sinh hiện tại của các vị trí kiểm tra. Những dữ liệu này bao gồm tại các vị trí kiểm tra ở cả trạng thái bẩn và trạng thái đã vệ sinh sạch sẽ. - Xác định các giá trị giới hạn: Sau khi có đủ các số liệu về tình hình vệ sinh ở từng vị trí kiểm soát, kết hợp với theo dõi quá trình sản xuất và những kết quả kiểm tra vệ sinh thông thƣờng sẽ tiến hành xây dựng mức kiểm soát vệ sinh bằng ATP quang sinh.
- Đo ATP quang sinh bằng thiết bị đo HY_LITE 2.
30 + Khoảng tuyến tính 0-99000 RLU + Có thể lƣu hơn 2000 kết quả đo + Tín hiệu nền < 10 RLU
+ Các dạng kiểm tra: HACCP, Test and store, Test only
+ Đầu dò: photomultiplier (PMT) loại cực nhạy có chức năng bảo vệ quá tải Trong phƣơng pháp xác định bằng ATP quang sinh có hai dạng dụng cụ lấy mẫu đƣợc sử dụng
+ Que lấy mẫu bề mặt:
Bôi lấy mẫu: Rút que lấy mẫu ra khỏi dụng cụ Clean-trace, bôi lên bề mặt kiểm tra với diện tích khoảng 10cm2
Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận đặt que lấy mẫu vào dụng cụ Clean-trace, ấn xuống và lắc để hoạt hóa mẫu trong vòng 10 giây.
Đọc kết quả: Đặt dụng cụ Clean-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và đợi đọc kết quả khoảng 10 giây sau đấy.
+ Que lấy mẫu nƣớc:
Bôi que lấy mẫu: Rút que lấy mẫu khỏi dụng cụ Aqua- trace, nhúng que lấy mẫu vào dung dịch kiểm tra
Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận đặt que lấy mẫu vào dụng cụ Aqua-trace, lắc để hoạt hóa mẫu trong vòng 10 giây.
Đọc kết quả: Đặt dụng cụ Aqua-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và đợi đọc kết quả trong vòng 10 giây sau đấy.
2.2.2.3. Ứng dụng máy đo quang UV-VIS U-1900 Đặc tính kỹ thuật Đặc tính kỹ thuật
Hệ quang: Ratio beam Bƣơc sóng: 190-1100nm Độ rộng dải quang phổ: 4 nm
Stray light: trong 0.5 % (220 nm NaI; 340 nm NaNO2) Độ chính xác bƣớc sóng: ± 0.5 nm
31 Độ tái lặp bƣớc sóng: ± 0.3 nm
Dạng đo: Photometry, Wavelength scan, Time scan, Multiple, Wavelength measurement
Photometric range: Abs (-3.000 tới 3.000) % T (0 tới 300%T)
Nồng độ (0.000 tới 9999)
Photometric Accuracy : ± 0.002 Abs ( 0 tới 0.5 Abs) ± 0.004 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs) % 0.3 T (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Photometric repeatability : ± 0.001 Abs ( 0 tới 0.5 Abs) ± 0.002 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs) % 0.15 T
Tốc độ scan bƣớc sóng: 10, 100, 200, 400, 800, 1200, 2400, 3600 nm/phút Baseline stability (độ trôi ): 0.0004 Abs/h (500nm, 2 tiếng sau khi bật máy) Baseline flatness: ± 0.002 Abs (200 tới 950 nm)
Baseline level: ± 0.00015 Abs (500nm) Nguồn sáng: WI và đèn D2
Detector: Silicon photodiode
Tiến hành: Các mẫu môi trƣờng phát quang đƣợc chuẩn bị. Sử dụng cuvet 20 mm cho phép đo. Chọn dải quét bƣớc sóng tà 190 nm - 1100 nm.
32
Chƣơng III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chúng tôi thực hiện kiểm tra vệ sinh ở một số điểm trọng yếu trong dây chuyền sản xuất bia nhƣ:
+ Các tec lên men + Máy lọc sản phẩm + Các tec sản phẩm
3.1. Phƣơng pháp phân tích truyền thống
3.1.1. Kiểm tra ở các tec lên men
Tec lên men 1
Bảng 2: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 1
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 x106 5.8 x106 5.2 x104 1.5 x103
Tổng nấm men, nấm mốc 4.2 x 103 3.7 x103 3.2 x103 1.0 x 102
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 4 2,0 2,0 <2,0
Tec lên men 2
Bảng 3: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 2
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 4.2 x106 3.7 x106 2.1 x104 1.0 x103
33
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 2,0 4,0 2,0 2,0
Tec lên men 3
Bảng 4: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 3
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.7 x106 5.5 x106 4.7 x104 1.8 x103
Tổng nấm men, nấm mốc 3.4 x103 3.3x103 2.6 x103 0.5 x 102
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 4,0 2,0 <2,0 2,0
3.1.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm
Máy lọc sản phẩm đợt 1
Bảng 5: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 1
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.2 x103 5.9 x103 3.0 x102 0.5 x102
Tổng nấm men, nấm mốc 5.6 x102 5.7x102 2.0 x102 1.3 x 10
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
34
Máy lọc sản phẩm đợt 2
Bảng 6: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 2
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.1 x103 6.0 x103 2.0 x102 5 x10
Tổng nấm men, nấm mốc 4.7 x102 4.8 x102 3.0 x102 12
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 4,0 <2,0 2,0 <2,0
Máy lọc sản phẩm đợt 3
Bảng 7: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 3
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.9 x103 5.7 x103 1.0 x102 20
Tổng nấm men, nấm mốc 5.0 x102 4.7 x102 5.0 x10 12
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 2,0 2,0 2,0 <2,0
3.1.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm
Tec sản phẩm 1
Bảng 8: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 1
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
35
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng nấm men, nấm mốc 4.8 x102 4.2 x102 3.0 x10 17
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 2,0 <2,0 2,0 <2,0
Tec sản phẩm 2
Bảng 9: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 2
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.0 x103 6.1 x103 8.0 x102 12
Tổng nấm men, nấm mốc 5.7 x102 5.4 x102 6.2 x10 14
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 2,0 <2,0 2,0 <2,0
Tec sản phẩm 3
Bảng 10: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 3
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 x103 4.8 x103 9 x102 17
Tổng nấm men, nấm mốc 4.8 x102 4.5 x102 3.0 x10 11
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
36
3.2. Phƣơng pháp ATP quang sinh học
3.2.1. Kiểm tra ở các tec lên men
Bảng 11: Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp ATP quang sinh ở các tec lên men
Số thứ tự Tên mẫu Tec 1 (RLU) Tec 2 (RLU) Tec 3 (RLU)
1 Vệ sinh lần 1 6608 5500 6740
2 Vệ sinh lần 2 5460 4673 6580
3 Vệ sinh lần 3 520 510 495
4 Vệ sinh lần 4 295 297 285
Khi vệ sinh các tec lên men ở lần rửa thứ 1 và thứ 2 nƣớc còn bẩn, ở các tec đo đƣợc đều ở khoảng 6000 RLU. Từ lần 3 trở đi mức độ vệ sinh đã khá hơn, ở các tec đo đƣợc khoảng 500 RLU. Kết thúc quá trình kiểm tra (lần 4) mẫu đo đƣợc đạt ở mức dƣới 300 RLU ở cả 3 tec
3.2.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu lấy ở máy lọc sản phẩm đƣợc tiến hành sau khi xả tháo vải lọc, xả bỏ cặn lần đầu tiên trên các bản lọc.
Bảng 12: Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp ATP quang sinh ở máy lọc sản phẩm
Số thứ tự Tên mẫu Đợt 1 (RLU) Đợt 2 (RLU) Đợt 3 (RLU)
1 Vệ sinh lần 1 790 795 787
2 Vệ sinh lần 2 792 620 690
3 Vệ sinh lần 3 254 265 235
37
Ở hai lần vệ sinh đầu, máy lọc sản phẩm vẫn chƣa đƣợc sạch, sau lần thứ 3 vệ sinh kết quả RLU ở cả ba đợt đều nhỏ hơn 300 RLU. Ở máy lọc sản phẩm chỉ sau 3 lần đã có thể đạt yêu cầu vệ sinh.
3.2.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm
Bảng 13: Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp ATP quang sinh ở các tec sản phẩm
Số thứ tự Tên mẫu Tec 1 (RLU) Tec 2 (RLU) Tec 3 (RLU)
1 Vệ sinh lần 1 870 734 674
2 Vệ sinh lần 2 723 627 580
3 Vệ sinh lần 3 225 243 235
4 Vệ sinh lần 4 131 127 130
Sau lần 1 và lần 2, quá trình vệ sinh vẫn không thay đổi đáng kế. Đến lần 3, ở tất cả các tec đều đạt kết quả dƣới 300 RLU. Cũng nhƣ ở máy lọc sản phẩm, tec sản phẩm cũng đạt yêu cầu sau 3 lần vệ sinh.
3.3. Đánh giá sự tƣơng thích giữa kiểm tra vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống và đo ATP quang sinh truyền thống và đo ATP quang sinh
3.3.1. Mẫu đã biết trước nồng độ
Để so sánh sự tƣơng thích, chúng tôi chuẩn bị các mẫu thử đã biết trƣớc nồng độ. Mẫu đƣợc chuẩn bị từ nấm men Saccharomyces carlbergensis dùng trong sản xuất bia, với nồng độ ban đầu là 3.5 x 106 tế bào/mL Các mẫu đƣợc chuẩn bị với nhiều mức nồng độ khác nhau với hệ số pha loãng là 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 kết quả đƣợc trình bày ở bảng dƣới đây.
38
Bảng 14: Kết quả phân tích mẫu đã biết trƣớc nồng độ bằng cả phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh.
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
(CFU) Đo ATP (RLU)
Mẫu ban đầu 3.5 x 106 2302
Mẫu 10-1 3.5 x 105 747
Mẫu 10-2 3.5 x 104 243
Mẫu 10-3 3.5 x 103 158
Mẫu 10-4 3.5 x 102 132
Qua bảng kết quả ta thấy kết quả đo đƣợc từ phƣơng pháp ATP quang sinh và tổng số tế bào nấm men đếm đƣợc có sự tƣơng thích, số đơn vị RLU tăng dần khi số lƣợng tế bào tăng dần. Ở giai đoạn pha loãng giữa nồng độ mẫu 10-4 và mẫu 10-3, kết quả thay đổi không nhiều, nhƣng có sự nhảy vọt giữa mẫu 10-1 và 10-2 và đặc biệt là từ mẫu ban đầu so với mẫu đã pha loãng 10 lần ( Mẫu 10-1).
3.3.2. Mẫu trên dây truyền sản xuất bia (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a. Kiểm tra ở tec lên men
Tec 1
Bảng 15: Kết quả phân tích ở tec lên men 1 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU)
Rửa lần 1 5.8 x 106 6608
Rửa lần 2 5.4 x106 5460
Rửa lần 3 5.2 x 104 520
39
Tec 2
Bảng 16: Kết quả phân tích ở tec lên men 2 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU)
Rửa lần 1 4.2 x 106 5500
Rửa lần 2 3.7 x106 4673
Rửa lần 3 2.1 x 104 510
Rửa lần 4 1.0 x 103 297
Tec 3
Bảng 17: Kết quả phân tích ở tec lên men 3 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU)
Rửa lần 1 5.7 x 106 6740
Rửa lần 2 5.5 x106 6580
Rửa lần 3 4.7 x 104 495
Rửa lần 4 1.8 x 103 285
Nhận xét:
Quá trình vệ sinh, rửa lần 1 và lần 2 chƣa có sự thay đổi nhiều thể hiện ở cả phƣơng pháp xác định truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh. Từ lần rửa thứ 3, ở các tec lên men mới thấy biểu hiện rõ rệt sự thay đổi vệ sinh, và đến lần rửa cuối (lần 4) cùng thì sự đảm bảo vệ sinh mới đƣợc hoàn tất. Nếu dùng phƣơng phƣơng kiểm tra nhanh bằng ATP quang sinh thì tec lên men hoàn thành quá trình vệ sinh khi chỉ số RLU nhỏ hơn 300.
40 b. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm
Đợt 1
Bảng 18: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm đợt 1 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU)
Rửa lần 1 6.2 x 103 790
Rửa lần 2 5.9 x103 792
Rửa lần 3 3.0 x 102 254
Rửa lần 4 0.5 x 102 150
Đợt 2
Bảng 19: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm đợt 2 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU)
Rửa lần 1 6.1 x 103 795
Rửa lần 2 6.0 x103 620
Rửa lần 3 2.0 x 102 265
41
Đợt 3
Bảng 20: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm đợt 3 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU)
Rửa lần 1 5.9 x 103 787
Rửa lần 2 5.7 x103 690
Rửa lần 3 1.0 x 102 235
Rửa lần 4 2.0 x 10 117
Nhận xét: Ở máy lọc sản phẩm từ sau lần rửa thứ ba sự đảm bảo vệ sinh đã đƣợc hoàn tất, ở cả ba đợt chỉ số RLU đo đƣợc đều nhỏ hơn 300.
c. Kiểm tra ở các tec sản phẩm
Tec 1
Bảng 21: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 1 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) Đo ATP (RLU)
Rửa lần 1 6.3 x 103 870
Rửa lần 2 6.2 x103 723 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Rửa lần 3 10 x 102 225
42
Tec 2
Bảng 22: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 2 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu
khí (CFU) Đo ATP (RLU)
Rửa lần 1 6.0 x 103 734
Rửa lần 2 6.1 x103 627
Rửa lần 3 8.0 x 102 243
Rửa lần 4 1.2 x 10 127
Tec 3
Bảng 23: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 3 bằng phƣơng pháp