a. Dụng cụ thiết bị
+ Máy đo ATP HY_LITE 2
+ Máy quang phổ UV-VIS U-1900 + Nồi khử trùng
+ Tủ ấm + Tủ cấy + Máy đo pH
+ Pipet tự động, đầu hút
+ Đĩa petri, giấy nhôm, đèn cồn, bình xịt cồn, đũa thủy tinh,… b. Hóa chất
+ Plate count agar ( Peptone từ Carein 5,0g; cao nấm men 2,5g; D+ gluco 1,0g; agar 14,0g)
Cách pha:
Hòa tan 22,5 g PCA trong 1000 mL nƣớc cất. Hấp khử trùng ở 121o C, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,0 ± 0,2 ở 25 o
C.
+ Lactose broth ( Peptone 10g; lactose 10g; beef extract 6g; nƣớc cất 1000 mL).
26 Cách pha:
Môi trƣờng đơn: hòa tan 13g lactose broth trong 1000mL nƣớc cất. Môi trƣờng kép: hòa tan 26g lactose broth trong 1000 mL nƣớc cất.
Hòa tan môi trƣờng, sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 6,9 ± 0,2 ở 25 o
C.
+ Brilliant-green lactose (bile) broth ( Peptone 10g; lactose 10g; OX bile 20g; Brilliant – green 13 mL; nƣớc cất 1000 mL).
Cách pha:
Môi trƣờng đơn: hòa tan 40g trong 1000 mL nƣớc cất. Môi trƣờng kép: hòa tan 80g trong 1000 mL nƣớc cất.
Hòa tan môi trƣờng, sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,2 ± 0,2 ở 25 o
C. + Tryptone
Tryptone ( Peptone từ casein ): 20g. NaCl: 5g.
Nƣớc cất 1000 mL. Cách pha:
Hòa tan môi trƣờng, sau đó hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,5 ± 0.2 ở 25 o
C.
+ R2A agar (Yeast extract 0,5; proteose peptone 0,5; casein hydrolysat 0,5; glucose 0,5; starch soluble 0,5; natri pyruvat 0,3; K2HPO4 0,3; MgSO4 0,05; agar 12,0).
Cách pha:
Hòa tan 15.2 g trong 1000 mL nƣớc cất. Đem hấp khử trùng ở 121o
C trong vòng 15 phút. Sau khử trùng pH 7,2 ± 0,2 ở 25 o
C. + Kovacs
27
+ Fluoro cult (Tryptone 5,0; NaCl 5,0; Sorbit 1,0; Tryptophan 1,0; 4- brom-4chlor-3 indoly –B-D- glactogyranoside (X-gal) 0,08; 4- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
metylumbelliferyl –β-D-glucuronide (MGG) 0.05; 1-isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside 0.1 ).
Cách pha:
Môi trƣờng đơn: cân 17g/1000mL nƣớc cất Môi trƣờng kép: cân 34g/1000mL nƣớc cất
Hòa tan môi trƣờng, sau đó hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 6,8 ± 0,2 ở 25 oC.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1.Phương pháp kiểm tra vi sinh vật bằng nuôi cấy truyền thống
Phƣơng pháp truyền thống là phƣơng pháp phổ biến nhất trong các nghiên cứu vi sinh vật học. Trên môi trƣờng đặc mỗi vi sinh vật sẽ phát triển thành khuẩn lạc hoặc sự sinh khí và biểu hiện đục ở ống nghiệm. Dựa trên đấy có thể kiểm tra số lƣợng vi sinh vật trong mỗi đơn vị thể tích của dịch nghiên cứu. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc thƣờng đƣợc sử dụng để kiểm tra số lƣợng nấm men, nấm mốc.
+ Ƣu điểm của phƣơng pháp là không phát hiện nhầm các vi sinh vật chết hoặc các mảnh xác hữu cơ, vì chỉ có bào tử hoặc các tế bào sống mới phát triển thành khuẩn lạc hoặc cho phản ứng sinh khí.
+ Nhƣợc điểm: Khi làm dịch pha loãng không phải mọi vi sinh vật đều có thể tách khỏi bề mặt chất rắn để hòa tan vào nƣớc. Không có loại môi trƣờng dinh dƣỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển. Các vi sinh vật phát triển trên mỗi loại môi trƣờng chỉ tồn tại một nhóm sinh lý nhất định.
Đối với vi sinh vật mà những bào tử thƣờng dính chặt vào nhau thành từng chuỗi, từng đôi, từng khối thì khi phát triển trên môi trƣờng, thì mỗi chuỗi, mỗi khối chỉ hình thành một khuẩn lạc. Vì vậy số khuẩn lạc chƣa phản ánh đƣợc chính xác số tế bào, bào tử trong dịch nghiên cứu.
Khi cấy dịch pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy đƣợc số khuẩn lạc chênh nhau 10 lần. Vì vậy muốn kết quả phân tích có giá trị so sánh
28
tốt, chúng ta nên sử dụng một độ pha loãng thống nhất với từng nhóm vi sinh vật.
2.2.2.1.1.Phƣơng pháp xác định tổng số Coliform và E.coli
Cấy vào 5 ống đựng môi trƣờng canh thang lỏng nồng độ kép với một lƣợng 10 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống đều thả ống duham lộn ngƣợc. Tiếp theo, cấy vào 5 ống đựng môi trƣờng canh thang lỏng nồng độ đơn với một lƣợng 1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống đều thả ống duham lộn ngƣợc. Cấy vào 5 ống đựng môi trƣờng canh thang lỏng nồng độ đơn với một lƣợng 0.1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống đều thả ống duham lộn ngƣợc.
Ủ các ống sau khi cho mẫu vào ở nhiệt độ 35o
C trong 24 hoặc 48 h và quan sát. Với những ống có biểu hiện đục và sinh khí, chuyển tiếp lần lƣợt 10 mL , 1mL, 0.1mL vào 5 ống môi trƣờng brilliant kép và 5; 5 ống môi trƣờng Brilliant đơn, nuôi tiếp ở 35o
C sau 48 h. sau đấy quan sát và đọc kết quả theo bảng kết quả trong ISO 9308-phần II. Mẫu có coliform với biểu hiện đục và sinh khí ở ống.
Chuyển tiếp 10 mL, 1mL, 0.1 mL vào 5 ống môi trƣờng tryptone kép và 5; 5 ống môi trƣờng Tryptone đơn, nuôi tiếp ở 44oC sau 24 h. Cho vào mỗi ống vài giot Kovacs, nếu biểu hiện màu hồng trong ống, chứng tỏ sự có mặt của E.coli.
2.2.2.1.2.Tính tổng số nấm men, nấm mốc
Chuẩn bị dịch pha loãng và môi trƣờng đĩa thạch. Nấu từng loại môi trƣờng thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật. Hòa tan môi trƣờng rồi phân phối vào các lọ, khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở 121oC trong 15 phút. Lấy 1mL mẫu với tỷ lệ pha loãng nhất định cho vào các hộp đĩa thạch đã đƣợc khử trùng, mỗi mức pha loãng dùng 4 đĩa thạch. Sau đấy rót vào mỗi hộp đĩa khoảng 10 mL môi trƣờng thạch sau khử trùng và để nguội ở 40-50oC. Đậy nắp và xoay tròn mỗi hộp trên mặt tủ cấy, để nguội đến khi mặt thạch đông lại, ghi số mẫu và nồng độ pha loãng lên mỗi đáy hộp petri và bọc giấy báo rồi đem nuôi ở 35oC và đọc kết quả sau 48h ± 3.
29 2.2.2.1.3.Tổng vi sinh vật hiếu khí
Sử dụng môi trƣờng R2A agar, hòa tan với lƣợng 15,2g/1000 mL, tiếp theo đem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
Lấy 1 mL mẫu hoặc mẫu đã pha loãng cho vào hộp petri đã đƣợc khử trùng, rót vào khoảng 10 mL môi trƣờng R2A agar đã khử trùng, đậy nắp và xoay tròn đều mỗi hộp trên mặt tủ cấy, để nguội, đợi khi mặt thạch đông lại hoàn toàn sau đấy ghi tên mẫu và nồng độ pha loãng lên đáy hộp petri, bao giấy rồi đem nuôi ở 35oC trong vòng 48h ± 3. Khi đủ thời gian, đem ra đọc kết quả bằng cách đếm các khuẩn lạc trên đĩa thạch. Sau đấy báo cáo số khuẩn lạc trên một đơn vị thể tích mẫu tƣơng ứng.
2.2.2.2. Phương pháp xác định độ sạch bằng ATP quang sinh
Để nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp kiểm tra nhanh vệ sinh trong dây chuyền sản xuất bia bằng đo ATP quang sinh, các bƣớc cần phải tiến hành nhƣ sau:
- Nhận dạng các điểm kiểm tra: Các điểm kiểm tra đƣợc coi là các điểm kiểm soát tới hạn (CCP), đại diện cho hiệu quả của quá trình vệ sinh. Kết quả thu đƣợc sẽ phản ánh thực tế hiệu quả của quá trình vệ sinh.
Các điểm kiểm tra nói chung đƣợc chia làm hai nhóm:
Bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm và nhóm bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm.
- Lập kế hoạch lấy mẫu: Căn cứ sơ đồ sản xuất, xây dựng kế hoạch lấy mẫu, tần suất lấy mẫu cho phù hợp từng vị trí kiểm tra. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thu thập dữ liệu và xây dựng giới hạn thƣờng quy: Nội dung này giúp nhận diện tình trạng vệ sinh hiện tại của các vị trí kiểm tra. Những dữ liệu này bao gồm tại các vị trí kiểm tra ở cả trạng thái bẩn và trạng thái đã vệ sinh sạch sẽ. - Xác định các giá trị giới hạn: Sau khi có đủ các số liệu về tình hình vệ sinh ở từng vị trí kiểm soát, kết hợp với theo dõi quá trình sản xuất và những kết quả kiểm tra vệ sinh thông thƣờng sẽ tiến hành xây dựng mức kiểm soát vệ sinh bằng ATP quang sinh.
- Đo ATP quang sinh bằng thiết bị đo HY_LITE 2.
30 + Khoảng tuyến tính 0-99000 RLU + Có thể lƣu hơn 2000 kết quả đo + Tín hiệu nền < 10 RLU
+ Các dạng kiểm tra: HACCP, Test and store, Test only
+ Đầu dò: photomultiplier (PMT) loại cực nhạy có chức năng bảo vệ quá tải Trong phƣơng pháp xác định bằng ATP quang sinh có hai dạng dụng cụ lấy mẫu đƣợc sử dụng
+ Que lấy mẫu bề mặt:
Bôi lấy mẫu: Rút que lấy mẫu ra khỏi dụng cụ Clean-trace, bôi lên bề mặt kiểm tra với diện tích khoảng 10cm2
Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận đặt que lấy mẫu vào dụng cụ Clean-trace, ấn xuống và lắc để hoạt hóa mẫu trong vòng 10 giây.
Đọc kết quả: Đặt dụng cụ Clean-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và đợi đọc kết quả khoảng 10 giây sau đấy.
+ Que lấy mẫu nƣớc:
Bôi que lấy mẫu: Rút que lấy mẫu khỏi dụng cụ Aqua- trace, nhúng que lấy mẫu vào dung dịch kiểm tra
Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận đặt que lấy mẫu vào dụng cụ Aqua-trace, lắc để hoạt hóa mẫu trong vòng 10 giây.
Đọc kết quả: Đặt dụng cụ Aqua-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và đợi đọc kết quả trong vòng 10 giây sau đấy.
2.2.2.3. Ứng dụng máy đo quang UV-VIS U-1900 Đặc tính kỹ thuật Đặc tính kỹ thuật
Hệ quang: Ratio beam Bƣơc sóng: 190-1100nm Độ rộng dải quang phổ: 4 nm
Stray light: trong 0.5 % (220 nm NaI; 340 nm NaNO2) Độ chính xác bƣớc sóng: ± 0.5 nm
31 Độ tái lặp bƣớc sóng: ± 0.3 nm
Dạng đo: Photometry, Wavelength scan, Time scan, Multiple, Wavelength measurement
Photometric range: Abs (-3.000 tới 3.000) % T (0 tới 300%T)
Nồng độ (0.000 tới 9999)
Photometric Accuracy : ± 0.002 Abs ( 0 tới 0.5 Abs) ± 0.004 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs) % 0.3 T
Photometric repeatability : ± 0.001 Abs ( 0 tới 0.5 Abs) ± 0.002 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs) % 0.15 T
Tốc độ scan bƣớc sóng: 10, 100, 200, 400, 800, 1200, 2400, 3600 nm/phút Baseline stability (độ trôi ): 0.0004 Abs/h (500nm, 2 tiếng sau khi bật máy) Baseline flatness: ± 0.002 Abs (200 tới 950 nm)
Baseline level: ± 0.00015 Abs (500nm) Nguồn sáng: WI và đèn D2
Detector: Silicon photodiode
Tiến hành: Các mẫu môi trƣờng phát quang đƣợc chuẩn bị. Sử dụng cuvet 20 mm cho phép đo. Chọn dải quét bƣớc sóng tà 190 nm - 1100 nm.
32
Chƣơng III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chúng tôi thực hiện kiểm tra vệ sinh ở một số điểm trọng yếu trong dây chuyền sản xuất bia nhƣ: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Các tec lên men + Máy lọc sản phẩm + Các tec sản phẩm
3.1. Phƣơng pháp phân tích truyền thống
3.1.1. Kiểm tra ở các tec lên men
Tec lên men 1
Bảng 2: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 1
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 x106 5.8 x106 5.2 x104 1.5 x103
Tổng nấm men, nấm mốc 4.2 x 103 3.7 x103 3.2 x103 1.0 x 102
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 4 2,0 2,0 <2,0
Tec lên men 2
Bảng 3: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 2
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 4.2 x106 3.7 x106 2.1 x104 1.0 x103
33
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 2,0 4,0 2,0 2,0
Tec lên men 3
Bảng 4: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 3
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.7 x106 5.5 x106 4.7 x104 1.8 x103
Tổng nấm men, nấm mốc 3.4 x103 3.3x103 2.6 x103 0.5 x 102
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 4,0 2,0 <2,0 2,0
3.1.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm
Máy lọc sản phẩm đợt 1
Bảng 5: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 1
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.2 x103 5.9 x103 3.0 x102 0.5 x102 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tổng nấm men, nấm mốc 5.6 x102 5.7x102 2.0 x102 1.3 x 10
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
34
Máy lọc sản phẩm đợt 2
Bảng 6: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 2
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.1 x103 6.0 x103 2.0 x102 5 x10
Tổng nấm men, nấm mốc 4.7 x102 4.8 x102 3.0 x102 12
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 4,0 <2,0 2,0 <2,0
Máy lọc sản phẩm đợt 3
Bảng 7: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 3
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.9 x103 5.7 x103 1.0 x102 20
Tổng nấm men, nấm mốc 5.0 x102 4.7 x102 5.0 x10 12
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 2,0 2,0 2,0 <2,0
3.1.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm
Tec sản phẩm 1
Bảng 8: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 1
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
35
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng nấm men, nấm mốc 4.8 x102 4.2 x102 3.0 x10 17
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 2,0 <2,0 2,0 <2,0
Tec sản phẩm 2
Bảng 9: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 2
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.0 x103 6.1 x103 8.0 x102 12
Tổng nấm men, nấm mốc 5.7 x102 5.4 x102 6.2 x10 14
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliform (MPN) 2,0 <2,0 2,0 <2,0
Tec sản phẩm 3
Bảng 10: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 3
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 x103 4.8 x103 9 x102 17
Tổng nấm men, nấm mốc 4.8 x102 4.5 x102 3.0 x10 11
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
36
3.2. Phƣơng pháp ATP quang sinh học
3.2.1. Kiểm tra ở các tec lên men
Bảng 11: Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp ATP quang sinh ở các tec lên men
Số thứ tự Tên mẫu Tec 1 (RLU) Tec 2 (RLU) Tec 3 (RLU)
1 Vệ sinh lần 1 6608 5500 6740
2 Vệ sinh lần 2 5460 4673 6580
3 Vệ sinh lần 3 520 510 495
4 Vệ sinh lần 4 295 297 285
Khi vệ sinh các tec lên men ở lần rửa thứ 1 và thứ 2 nƣớc còn bẩn, ở các tec đo đƣợc đều ở khoảng 6000 RLU. Từ lần 3 trở đi mức độ vệ sinh đã khá hơn, ở các tec đo đƣợc khoảng 500 RLU. Kết thúc quá trình kiểm tra (lần 4) mẫu đo đƣợc đạt ở mức dƣới 300 RLU ở cả 3 tec
3.2.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm
Mẫu lấy ở máy lọc sản phẩm đƣợc tiến hành sau khi xả tháo vải lọc, xả bỏ cặn lần đầu tiên trên các bản lọc.
Bảng 12: Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp ATP quang sinh ở máy lọc sản phẩm
Số thứ tự Tên mẫu Đợt 1 (RLU) Đợt 2 (RLU) Đợt 3 (RLU)
1 Vệ sinh lần 1 790 795 787
2 Vệ sinh lần 2 792 620 690
3 Vệ sinh lần 3 254 265 235
37
Ở hai lần vệ sinh đầu, máy lọc sản phẩm vẫn chƣa đƣợc sạch, sau lần thứ 3 vệ sinh kết quả RLU ở cả ba đợt đều nhỏ hơn 300 RLU. Ở máy lọc sản phẩm chỉ sau 3 lần đã có thể đạt yêu cầu vệ sinh.
3.2.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 13: Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp ATP quang sinh ở các tec sản phẩm
Số thứ tự Tên mẫu Tec 1 (RLU) Tec 2 (RLU) Tec 3 (RLU)