3. Ý nghĩa khoa học của ựề tài
2.2.2 Xác ựịnh type virus gây bệnh LML Mở lợn trên ựịa bàn huyện Tĩnh Gia
- Tình hình chăn nuôi lợn và tình hình bệnh LMLM ở lợn trên ựịa bàn huyện Tĩnh Gia, tỉnh Thanh Hóa năm 2013.
- Chẩn ựoán, ựịnh type virus LMLM trên ựịa bàn 2 xã: Hải Ninh, Tân Dân của huyện Tĩnh Gia năm 2013.
- đánh giá các yếu tố nguy cơ gây bệnh LMLM tại 4 xã: Hải Ninh, Triêu Dương, Tân Dân, Hải Lĩnh của huyện Tĩnh Gia năm 2013.
2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Tình hình chăn nuôi lợn và tình hình dịch LMLM ở lợn trên ựịa bàn huyện Tĩnh Gia và tỉnh Thanh Hóa năm 2013
- Thu thập và phân tắch số liệu: Số liệu ựiều tra về tình hình chăn nuôi lợn và tình hình dịch bệnh LMLM ở lợn ựược thu thập thông qua các tài liệu lưu trữ của Cục thống kê, Chi cục thú y, Trạm thú y (số liệu thứ cấp) về các chỉ tiêu:
Tổng số lợn (con)
Số lợn mắc bệnh LMLM (con) Số lợn bị tiêu hủy (con)
-Tiến hành dùng bảng hỏi (phiếu ựiều tra) ựể ựiều tra các hộ chăn nuôi; Kết hợp phỏng vấn sâu cán bộ thú y cơ sở ựể thu thập thêm thông tin.
Xử lý bằng phầm mềm Microsoft Excel 2007 các số liệu trên ựể nắm ựược tình hình chăn nuôi lợn và tình hình dịch LMLM ở lợn tại Thanh Hóa năm 2013.
2.2.2 Xác ựịnh type virus gây bệnh LMLM ở lợn trên ựịa bàn huyện Tĩnh Gia năm 2013 năm 2013
Vật liệu:
6 mẫu bệnh phẩm là biểu mô mụn nước của lợn mắc bệnh LMLM ựược nuôi tại 6 hộ chăn nuôi của huyện Tĩnh Gia năm 2013.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
Vật tư, hóa chất:
- Bộ kit ELISA dùng ựể phát hiện các kháng nguyên của virus LMLM với các serotypes O, A, C, và Asia1 của Pirbright - UK.
- Hóa chất cần thiết: các hóa chất tinh khiết của Merck như NaOH, HCl, H2SO4 , Na2HPO4, KH2PO4, ựỏ phenol, nước ựề ion.
- Thiết bị: Hệ thống thiết bị dùng trong phân tắch, xét nghiệm và chẩn ựoán bệnh của Trung tâm chẩn ựoán thú y vùng III.
Phương pháp:
Xác ựịnh type virus O, A, C, Asia 1 gây bệnh LMLM ở lợn dựa theo phương pháp của TCVN 8400-1: 2010.
Lấy mẫu:
Lấy tối thiểu 2g tổ chức biểu mô của mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ và dịch mụn nước, sau ựó ựược bảo quản trong dung dịch ựệm PBS 0,04M có Glyxerin, pH từ 7,2 Ờ 7,6, ở -20ồC.
Biểu mô và mụn nước dùng ựể phát hiện kháng nguyên ựược lấy trong vòng 7 ngày kể từ khi phát hiện bệnh.
Xử lý bệnh phẩm:
- Mẫu bệnh phẩm là biểu mô của mụn nước ựược nghiền trong cối chày sứ với dung dịch PBS 0,04M tỷ lệ 1:10. Ly tâm huyễn dịch bệnh phẩm 2000 vòng/phút. Hút lấy dịch nước trong ở phắa trên rồi cho dung dịch kháng khuẩn vào (0,01 ml/ 1 ml huyễn dịch), lắc ựều trong 15 ựến 20 phút rồi tiến hành làm phản ứng ELISA.
Bố trắ thắ nghiệm:
Khay vi thể 96 giếng, ựược ựánh số hàng ngang theo thứ tự từ 1-12 và theo hàng dọc từ A-H (12 cột, 8 hàng).
+ Theo hàng dọc: ựĩa ựược chia làm 2 phần từ A-D và từ E-H tương ứng từng hàng với các serotype O, A, C, Asia1.
+ Theo hàng ngang: từ cột số1- 4 là các ựối chứng kháng nguyên (+) mạnh và các kháng nguyên (+) yếu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 (+) mạnh (+) yếu Blank Mẫu 1 Mẫu 3 Mẫu 5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 O 1/5 1/25 1/125 1/625 A 1/5 1/25 1/125 1/625 C 1/5 1/25 1/125 1/625 Asia 1 1/5 1/25 1/125 1/625 O 1/5 1/25 1/125 1/625 A 1/5 1/25 1/125 1/625 C 1/5 1/25 1/125 1/625 Asia 1 1/5 1/25 1/125 1/625
Mẫu 2 Mẫu 4 Mẫu 6
Hình 2.1. Sơ ựồ ựĩa phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên Tiến hành xét nghiệm:
Sử dụng phương pháp ELISA ựể phát hiện kháng nguyên virus LMLM ựược tiến hành theo sơ ựồ sau:
Hấp thụ kháng thể thỏ virus LMLM của các serotyp O, A, C, Asia1 ựược pha 1:1000 với dung dịch gắn Carbonate/bicarbonate 50ộl/1 giếng theo hàng phản ứng.
Ủ qua ựêm ở 4ồC hoặc lắc 1 giờ ở 37ồC Rửa 3 lần (dung dịch PBS 0,002M), thấm khô Cho 50 ộl kháng nguyên ựối chứng (+) của từng type virus O, A, C, Asia1 và các huyễn dịch mẫu bệnh phẩm cần kiểm tra vào các hàng tương ứng ựã gắn kháng thể thỏ.
Lắc, ủ 1 giờ ở 37ồC Rửa 3 lần, thấm khô
Cho 50ộl kháng thể chuột lang kháng virus LMLM của từng serotyp O, A, C, Asia1 vào các hàng tương ứng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33 Lắc, ủ 1 giờ ở 37ồC
Rửa 3 lần, thấm khô
Cho 50ộl Conjugate ựã ựược pha loãng vào mối giếng Lắc, ủ 1 giờ ở 37ồC
Rửa 3 lần, thấm khô Cho 50ộl One shot sustrate vào mỗi giếng
để ở nhiệt ựộ phòng 15 phút, tránh ánh sáng Dừng phản ứng với 50ộl H2SO4 1,25M
đọc kết quả bằng máy ựọc ELISA ở bước sóng 492nm
điều kiện chấp nhận kết quả:
Ít nhất 3 serotype ựối chứng có giá trị OD trung bình sau khi ựã trừ trung bình OD blank > 0.1 với cả 4 nồng ựộ ựều có hệ số pha loãng là 5
Mỗi serotype ựối chứng phải có ắt nhất 3 nồng ựộ pha loãng bậc 5 có giá trị OD trung bình sau khi ựã trừ trung bình OD blank > 0.1
đánh giá kết quả
Mẫu ựược xem là dương tắnh khi ựủ các ựiều kiện sau:
- Mẫu xét nghiệm có giá trị OD trung bình sau khi ựã trừ trung bình OD blank > 0.1
- Nếu ựồng thời có nhiều serotype có gắa trị OD trung bình sau khi trừ trung bình OD blank > 0.1, thì serotype ựược xem là dương tắnh khi giá trị trung bình OD của serotype ựó trừ ựi trung bình OD blank phải gấp ựôi giá trị trung bình OD của serotype có giá trị tiếp theo trừ ựi trung bình OD blank.
- Nếu mẫu xét nghiệm có giá trị OD trung bình sau khi ựã trừ trung bình OD blank dừng ở 0.1 (=0.1) thì có thể làm lại (retesting) hoặc tiến hành phân lập mẫu trên tế bào (tissus culture) và kiểm tra lại bằng ELISA.
- Nếu mẫu xét nghiệm có giá trị OD trung bình sau khi ựã trừ trung bình OD blank mà < 0.1 thì mẫu này ựược ghi nhận là âm tắnh với serotype tương ứng ựó.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34