2.2.2.7.1. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc
Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc.
Phương pháp đếm khuẩn lạc có thể được thực hiện bằng kỹ thuật hộp trãi và hộp đổ với các thiết bị hỗ trợ để đọc kết quả. Trong phương pháp này cần phải thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán.
Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường và điều kiện ủ. Cần thực hiện lặp lại ít nhất 2 đĩa để giảm thiểu sai số.
Mặc dù vẫn có một số nhược điểm nhưng phương pháp này vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào sống. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu. Phương pháp này được
sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, bệnh phẩm và thực phẩm.
* Pha loãng mẫu theo dãy thập phân:
Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 1/10, 1/100, 1/1000… Mỗi bậc pha loãng là 1/10 được thực hiện bằng cách dùng 1ml mẫu thêm 9ml nước hoặc môi trường trong ống nghiệm. Sau khi lắc kỹ sẽ được độ pha loãng 1/10.
* Tạo hộp đổ
Chuyển 1 ml dịch pha loãng vào giữa đĩa pêtri. Đổ 25-30 ml môi trường thạch đĩa (35-40 oC) vào đĩa pêtri. Lắc nhẹ đĩa pêtri lần lượt theo hai chiều xuôi và ngược chiều kim đồng hồ. Khi thạch đã đông cứng thì lật ngữa đĩa pêtri và cho vào ủ trong tủ ấm 37 o
C. * Tính kết quả
-Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 15 - 300 khuẩn lạc để tính giá trị trung bình của các nồng độ pha loãng tính ra số lượng khuẩn lạc
-Sự phân bố của các khuẩn lạc trên các đĩa phải hợp lí, độ pha loãng càng
cao thì số khuẩn lạc càng ít
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính bằng công thức:
Mi(CFU/ml)=Ai × Di/V (2.1) Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình/đĩa
Di là độ pha loãng.
Mật độ tế bào trung bình Mi trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau. Công thức nêu trên được áp dụng khi 2 đĩa có cùng một độ pha loãng cho số khuẩn lạc thích hợp.
Làm tròn kết quả có được, chỉ giữ lại hai số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n.
2.2.2.7.2. Mô tả quá trình thực nghiệm vi sinh
Hoạt tính kháng nấm của Ag nano/SiO2 được đánh giá bằng phương pháp gây độc môi trường nuôi cấy và đếm số khuẩn lạc: Xác định phần trăm ức chế sự phát triển nấm Aspergillus niger var Tieghn ( ~ 106 CFU/ml) và Penicillium citrinum Thom ( ~ 104 CFU/ml) của bột Ag nano/SiO2 theo dãy nồng độ là: 30, 50, 70, 100 và 150 ppm Ag nano. Sử dụng môi trường thạch Sabouraud và dung dịch pha loãng nước pepton vô trùng để nuôi cấy, xác định tổng số nấm mốc theo TCVN-5165-90 [7]. Phương pháp kiểm tra tổng số bào tử nấm mốc và % ức chế nấm theo công thức sau:
η (%) = 100 ( N1 – N2 ) / N1 (2.2)
Trong đó:
N1: số khuẩn lạc trong đĩa đối chứng (không có Ag nano/SiO2) N2: Số khuẩn lạc trong đĩa của mẫu khảo sát (có Ag nano/SiO2)