Máy đo phổ quang học UV-2401PC, Shimadzu, Nhật Bản, Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ.
Nguồn gamma Co-60 (SVST Co-60) với suất liều 1,3 kGy/h tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, Tp. HCM.
Máy đo TEM: JEM-1400, JEOL, Nhật bản, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia Vật liệu Polymer và Composite, Đại học Bách khoa, Tp. HCM.
Máy đo FE-SEM S4800 HITACHI, JAPAN, Khu công nghệ cao, Tp. HCM.
Máy đo phổ nhiễu xạ tia X (XRD): X Pert' Pro, Panalytical, Hà Lan, Trung tâm Hạt nhân Tp. HCM.
Cân phân tích, máy khuấy từ, tủ sấy và nhiều thiết bị dụng cụ phòng thí nghiệm khác của Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ .
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Chế tạo Ag nano/SiO2 bằng phƣơng pháp chiếu xạ gamma Co-60
Khảo sát nồng độ SiO2 tối ƣu: khi cho SiO2 vào etanol, ở nồng độ SiO2 thấp có hiện tượng tách lớp SiO2 và etanol, tăng dần hàm lượng SiO2 để đạt được hệ phân tán dạng paste (bột nhão) và nồng độ SiO2 khảo sát tối ưu là 9%.
Chế tạo mẫu Ag nano/SiO2 theo nồng độ Ag+ có công thức như sau: M1: SiO2 9% / Etanol 80% / Ag+ 5mM
M2: SiO2 9% / Etanol 80% / Ag+ 10mM M3: SiO2 9% / Etanol 80% / Ag+ 20mM
Ngâm SiO2 trong etanol cho đến trương, sau đó khuấy đều trong 1 giờ, nồng độ SiO2 là 9% (w/v). Hòa tan AgNO3 trong nước cất, cho từ từ dung dịch AgNO3
vào hệ phân tán SiO2 đạt nồng độ 5, 10 và 20 mM, khuấy đều trong 30 phút. Đưa hỗn hợp Ag+/SiO2 vào lọ thủy tinh có nắp đậy. Chiếu xạ theo liều 4, 8, 12 kGy... trên nguồn gamma Co-60 (SVST Co-60), suất liều 1,3 kGy/h tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, TP HCM.
Hình 2.1: Quá trình chế tạo Ag nano/ SiO2
2.2.2. Xác định các đặc trƣng tính chất của Ag nano/SiO2
2.2.2.1. Đo phổ UV-Vis
Mẫu Ag+/SiO2 sau khi chiếu xạ, để ổn định khoảng 2 giờ, pha loãng bằng nước cất đến nồng độ 0,1 mM (tính theo nồng độ Ag+). Đo phổ UV-Vis trên máy UV- 2401 PC, Shimadzu, Nhật Bản, dùng cuvet thạch anh 1cm. Từ phổ UV-Vis, xác định liều xạ chuyển hóa bão hòa (Dbh) Ag+ thành Ag0 thông qua giá trị mật độ quang (OD) tại bước sóng hấp thụ cực đại (max).
SiO2 Dd AgNO3 ROH 5mM 10mM 20mM - ray
Liều xạ chuyển hóa bão hòa Ag+ thành Ag0 là liều mà từ giá trị này trở đi thì mật độ quang thay đổi không đáng kể, hoặc mật độ quang suy giảm và bước sóng hấp thụ cực đại (λmax) dịch chuyển về thang có giá trị lớn hơn.
2.2.2.2. Tạo mẫu Ag nano/SiO2 dạng bột
Để thuận lợi cho quá trình chụp ảnh TEM, SEM, phân tích hàm lượng bạc, lưu trữ mẫu và pha vào sơn nước. Mẫu M1, M2 và M3 sau khi đạt được liều xạ chuyển hóa bão hòa ở dạng bột nhão (paste), đổ ra đĩa thủy tinh, sấy ở nhiệt độ 60oC và nghiền bi tạo thành bột mịn. Hòa bột Ag nano/SiO2 vào nước cất đến nồng độ Ag nano 10 ppm đo trên máy quang phổ UV-Vis khảo sát đặc trưng quang học của Ag nano/SiO2 dạng bột.
2.2.2.3. Chụp ảnh TEM
Bột Ag nano/SiO2 được chụp ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Bột Ag nano/SiO2 được phân tán trong nước cất. Nhỏ giọt keo bạc nano lên lưới đồng (300 mesh) đã phủ lớp carbon, làm khô tự nhiên ~ 15 phút. Kích thước hạt Ag nano trung bình được xác định bằng phương pháp đếm hạt từ ảnh TEM với tổng số hạt từ 50-100 hạt. Phần mềm Adobe Photoshop CS2 phiên bản 9.0 được sử dụng cho việc đếm hạt từ ảnh TEM.
2.2.2.4. Đo phổ XRD
Mẫu bột Ag nano/SiO2 với hàm lượng bạc ~ 1,2% (10 mM) được đo nhiễu xạ tia X. Từ phổ XRD tính kích thước tinh thể trung bình của hạt bạc nano (t) theo phương trình Debye-Scherrer: t (Ao
) = 0,9 / ( cos) [17, 45]. Trong đó:
= 1,54 Ao ( bước sóng tia X khi chiếu xạ Cu K)
: góc Bragg
: độ rộng một nửa chiều cao đỉnh cực đại (Radian).
Hàm lượng bạc (Agn0) trong mẫu được xác định bằng máy đo quang phổ hấp thu nguyên tử (Atomic Absorption Spectrophotometric - AAS) tại Trung tâm Phân tích Dịch vụ Thí nghiệm Tp. HCM. Kết quả phân tích cho biết hàm lượng bạc tổng số trong bột Ag nano/SiO2.
2.2.2.6. Khảo sát độ ổn định kích thƣớc của Ag nano/SiO2 khi phối trộn trong sơn nƣớc
Mẫu Ag nano/SiO2 dạng bột chế tạo từ mẫu có nồng độ Ag+ ban đầu 10 mM được hòa vào sơn nước (chưa có chất kháng nấm) đạt nồng độ 100 ppm, khấy trong 1h, tốc độ khuấy 1000 vòng/phút. Khảo sát độ ổn định kích thước Ag nano/SiO2
khi trộn trong sơn nước bằng ảnh chụp SEM theo thời gian: vừa pha xong, sau 3 tháng và sau 6 tháng.
2.2.2.7. Khảo sát hoạt tính kháng nấm của Ag nano/SiO2 2.2.2.7.1. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 2.2.2.7.1. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc
Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc.
Phương pháp đếm khuẩn lạc có thể được thực hiện bằng kỹ thuật hộp trãi và hộp đổ với các thiết bị hỗ trợ để đọc kết quả. Trong phương pháp này cần phải thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán.
Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường và điều kiện ủ. Cần thực hiện lặp lại ít nhất 2 đĩa để giảm thiểu sai số.
Mặc dù vẫn có một số nhược điểm nhưng phương pháp này vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào sống. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu. Phương pháp này được
sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, bệnh phẩm và thực phẩm.
* Pha loãng mẫu theo dãy thập phân:
Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 1/10, 1/100, 1/1000… Mỗi bậc pha loãng là 1/10 được thực hiện bằng cách dùng 1ml mẫu thêm 9ml nước hoặc môi trường trong ống nghiệm. Sau khi lắc kỹ sẽ được độ pha loãng 1/10.
* Tạo hộp đổ
Chuyển 1 ml dịch pha loãng vào giữa đĩa pêtri. Đổ 25-30 ml môi trường thạch đĩa (35-40 oC) vào đĩa pêtri. Lắc nhẹ đĩa pêtri lần lượt theo hai chiều xuôi và ngược chiều kim đồng hồ. Khi thạch đã đông cứng thì lật ngữa đĩa pêtri và cho vào ủ trong tủ ấm 37 o
C. * Tính kết quả
-Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 15 - 300 khuẩn lạc để tính giá trị trung bình của các nồng độ pha loãng tính ra số lượng khuẩn lạc
-Sự phân bố của các khuẩn lạc trên các đĩa phải hợp lí, độ pha loãng càng
cao thì số khuẩn lạc càng ít
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính bằng công thức:
Mi(CFU/ml)=Ai × Di/V (2.1) Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình/đĩa
Di là độ pha loãng.
Mật độ tế bào trung bình Mi trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau. Công thức nêu trên được áp dụng khi 2 đĩa có cùng một độ pha loãng cho số khuẩn lạc thích hợp.
Làm tròn kết quả có được, chỉ giữ lại hai số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n.
2.2.2.7.2. Mô tả quá trình thực nghiệm vi sinh
Hoạt tính kháng nấm của Ag nano/SiO2 được đánh giá bằng phương pháp gây độc môi trường nuôi cấy và đếm số khuẩn lạc: Xác định phần trăm ức chế sự phát triển nấm Aspergillus niger var Tieghn ( ~ 106 CFU/ml) và Penicillium citrinum Thom ( ~ 104 CFU/ml) của bột Ag nano/SiO2 theo dãy nồng độ là: 30, 50, 70, 100 và 150 ppm Ag nano. Sử dụng môi trường thạch Sabouraud và dung dịch pha loãng nước pepton vô trùng để nuôi cấy, xác định tổng số nấm mốc theo TCVN-5165-90 [7]. Phương pháp kiểm tra tổng số bào tử nấm mốc và % ức chế nấm theo công thức sau:
η (%) = 100 ( N1 – N2 ) / N1 (2.2)
Trong đó:
N1: số khuẩn lạc trong đĩa đối chứng (không có Ag nano/SiO2) N2: Số khuẩn lạc trong đĩa của mẫu khảo sát (có Ag nano/SiO2)
2.2.2.8. Đánh giá khả năng kháng nấm Aspergillus niger var Tieghn của sơn
nƣớc đã đƣợc pha trộn với Ag nano/SiO2
- Khảo sát ở điều kiện nhiệt độ thường nhiều hơi ẩm
Sơn nước có và không có Ag nano/SiO2 được sơn lên các tấm đan, cấy nấm
Aspergillus niger var Tieghn lên màng sơn. Các tấm đan đặt trong môi trường không khí có nhiều hơi ẩm, được tưới nước hằng ngày và quan sát theo thời gian.
- Khảo sát trong điều kiện phòng thí nghiệm
Sơn nước có và không có Ag nano/SiO2 được sơn lên vải PE, để khô sau 2 ngày và tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế nấm Aspergillus niger var
Tieghn của màng sơn có chứa Ag nano/SiO2 (nồng độ Ag nano 100 ppm) với số khuẩn lạc nấm trong dung dịch nước là 103 CFU/mL.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Đặc trƣng phổ hấp thụ UV-Vis của Ag nano/SiO2 sau chiếu xạ
Hình 3.1: Phổ UV-Vis mẫu Ag nano/SiO2 với nồng độ Ag+ ban đầu 5mM theo liều xạ, a) 0 kGy, b) 4 kGy, c) 8 kGy, d) 12 kGy, e) 16 kGy, f) 20 kGy
Phổ hấp thụ UV-Vis (hình 3.1) của hệ phân tán Ag nano/SiO2 với nồng độ Ag+ ban đầu là 5 mM tại các liều xạ khác nhau cho thấy từ liều xạ 4 kGy phổ UV-Vis xuất hiện đỉnh hấp thụ đặc trưng max ~ 411 nm trong khi phổ trước chiếu xạ không có đỉnh hấp thụ đặc trưng này. Khi liều xạ tăng, OD tăng và max trong khoảng liều
xạ từ 4-20 kGy tương ứng là 408-426 nm. Như đã biết, bạc nano có đặc trưng bước sóng hấp thụ cực đại trong vùng ánh sáng thấy được (max: 390-450 nm), max phụ thuộc vào kích thước, hình dạng của cluster bạc nano tạo thành trong quá trình chiếu xạ [15, 36]. Vì vậy phổ hấp thụ trong hình 4 chứng tỏ bạc nano tạo thành trên nền SiO2.
Khảo sát liều chuyển hóa (Ag+ Ag0) bão hòa
Liều xạ chuyển hóa bão hòa (Dbh) là liều xạ cần để chuyển hoàn toàn Ag+ thành Ag0. Phổ hấp thụ sau chiếu xạ mẫu Agnano/SiO2 với nồng độ Ag+ 5 mM được trình bày trên hình 3.1. Khi liều xạ tăng, OD của bạc nano tăng đến liều xạ 12 kGy thì đạt giá trị ổn định (OD ~ 1,4). Như vậy, 12 kGy là liều xạ cần thiết để chuyển 5mM Ag+ thành Ag0 hay liều xạ 1 kGy có thể khử hoàn toàn 0,42 mM Ag+ trong hệ phân tán silica thành Ag0. Kết quả của các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy, hiệu suất tạo gốc khử (e-aq, H, CH3
CHOH) là 6/100eV tương ứng với
liều xạ 1 kGy có thể khử hoàn toàn 0,57 mM Ag+ [16]. Theo Ramnani và cộng sự [36], để khử hoàn toàn 0,5 mM Ag+ thành bạc nguyên tử cần liều xạ là 0,9 kGy. Trong khi đó, công trình nghiên cứu của A. Sárkány và cộng sự [39], cần liều xạ 8 kGy để khử hoàn toàn 2,5 mM Ag+
. Kết quả thí nghiệm nhận được trong công trình này cho thấy để khử hoàn toàn 1mM Ag+ Ag0 cần liều xạ 2,4 kGy, cao hơn so với tính toán lý thuyết. Nguyên nhân của sai khác này có thể là oxi tự do trong mẫu làm giảm hiệu suất của quá trình khử.
Hình 3.2: Phổ UV-Vis mẫu Ag nano/SiO2 với nồng độ Ag+ ban đầu 10 mM (a) và 20 mM (b) theo liều xạ
b) a)
0 0.5 1 1.5 2 0 20 40 60 LiÒu x¹ (kGy) OD 5 mM 10 mM 20 mM
Hình 3.3: Đồ thị OD theo liều xạ của các mẫu sau chiếu xạ
Khảo sát tương tự kết quả hình 3.2 và 3.3 cho thấy Dbh của các mẫu Ag nano/SiO2 có nồng độ Ag+ ban đầu 10 và 20 mM tương ứng là 24 và 36 kGy.
3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ Ag+
đến kích thƣớc hạt Ag nano
Hình 3.4: Phổ UV-Vis tại Dbh của mẫu Ag nano/SiO2 có nồng độ Ag+ ban đầu 5, 10 và 20 mM
Liều xạ (kGy) OD
Phổ UV-Vis ở liều xạ bão hòa của Ag nano/SiO2 có nồng độ Ag+ ban đầu 5, 10 và 20 mM (hình 3.4) cho thấy, khi nồng độ bạc ion ban đầu càng cao, bạc nano tạo thành có OD càng giảm và max chuyển dời về thang có giá trị lớn hơn. Kết quả này được thể hiện rõ hơn trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: OD, max của Ag nano từ mẫu Ag nano/SiO2 có nồng độ Ag+ ban đầu 5, 10 và 20 mM
Nồng độ Ag+ (mM) OD max, nm
5 1,42 418,5
10 1,13 439,0
20 0,49 447,5
Kết quả bảng 3.1 cho thấy khi tăng nồng độ Ag+ thì max của Ag nano tăng và OD giảm. Cụ thể, max đạt giá trị 418,5; 439,0; 447,5 nm và OD là 1,42; 1,13; 0,49 tương ứng đối với mẫu có nồng độ Ag+
ban đầu là 5, 10 và 20 mM. Kết quả thu được chứng tỏ rằng khi nồng độ Ag+
càng cao, Ag nano tạo thành có kích thước hạt càng lớn. Điều này cũng được ghi nhận trong nghiên cứu chế tạo dung dịch Ag nano sử dụng poly vinylalcol (PVA) làm chất ổn định [13].
3.3. Khảo sát kích thƣớc hạt và cấu trúc đặc trƣng của Ag nano
Hình 3.5: Phổ UV-Vis (a) và ảnh chụp (b) của mẫu Ag nano/SiO2 dạng bột khô chế tạo từ mẫu Ag+ ban đầu 10mM.
a)
Để thuận lợi cho việc xác định cấu trúc đặc trưng, các mẫu Ag nano/SiO2 dạng paste được chuyển thành dạng bột khô.
Đặc trưng phổ hấp thụ UV-Vis các mẫu Ag nano/SiO2 dạng bột khô được thể hiện qua hình 3.5a. max và OD của mẫu Ag nano/SiO2 dạng bột khô có hàm lượng Ag+ ban đầu 5, 10 và 20 mM tương ứng là 417,5 (0,24), 436,5 (0,14), 437,5 (0,07). So sánh với OD của Ag nano/SiO2 dạng paste thấy rằng sau khi sấy khô OD giảm. Mẫu Ag nano/SiO2 với hàm lượng Ag+ ban đầu 5mM có max và OD khi đo ở dạng paste tương ứng là 418,5 nm và 1,42, trong khi đó dạng bột là 417,5 nm và 0,24. OD giảm có thể được giải thích là do sự liên kết giữa các hạt Ag nano/SiO2 sau khi sấy khô. Các mẫu Ag nano/SiO2 dạngbột (hình 3.5b) được sử dụng phân tích hàm lượng bạc (phương pháp AAS), kích thước hạt bạc nano (d), cấu trúc tinh thể hạt Ag nano thông qua chụp ảnh TEM và phổ XRD.
Kết quả phân tích hàm lượng bạc trong mẫu Ag nano/SiO2 (nồng độ Ag+ ban đầu 10mM) là khoảng 11.360 ppm (phụ lục 1). . a) d ~ 5-20 (nm) b) d ~15-30 (nm)
Hình 3.6: Ảnh TEM mẫu Ag nano/SiO2 với nồng độ Ag+ ban đầu a) 5 mM, b) 10 mM và c) 20 mM.
Như đã trình bày ở trên, mẫu Ag nano/SiO2 dạng bột khô có mật độ quang giảm từ 0,24 đến 0,07 khi tăng nồng độ Ag+ từ 5 đến 20 mM. Kết quả này có thể suy đoán kích thước hạt bạc nano tăng khi tăng nồng độ Ag+. Điều này được thể hiện rõ hơn qua kích thước hạt của bạc nano xác định từ ảnh TEM. Kết quả ảnh TEM hình 3.6, cho thấy kích thước hạt bạc nhỏ hơn 40 nm đối với cả ba nồng độ, mẫu Ag nano/SiO2 với nồng độ Ag+ 5, 10 và 20 mM có kích thước hạt bạc nano tương ứng khoảng 5-20, 15-30 và 20-40 nm. T. Tuval [47] cùng cộng sự đã nghiên cứu chế tạo Ag nano gắn trên SiO2 sử dụng phương pháp polyol kết hợp vi sóng, phản ứng có sự hiện diện polyme PEG 400 làm dung môi. Kết quả cho thấy Ag nano tạo thành có kích thước khoảng 20 nm trên bề mặt hạt SiO2, nồng độ bạc ion và SiO2 sử dụng ban đầu tương ứng là 11 mM và 0,3%. Sự gia tăng nồng độ Ag+ trong khi hàm lượng SiO2 không đổi, bạc nano tạo thành có kích thước hạt tăng. Điều này có thể là do khi tăng nồng độ bạc, hiệu quả cản trở không gian của hệ
c) d ~20-40 (nm)
phân tán SiO2 đối với hạt Ag nano tạo thành giảm, làm tăng sự kết tụ. Ngoài ra kích thước tinh thể trung bình của hạt Ag nano còn được xác định qua phổ XRD.