L. sprorogenes
3.1.Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng L sprorogenes
3.1.1. Hình thái thái tế bào và tính chất nuôi cấy
3.1.1.1. Hình thái khuẩn lạc
Chủng L. sprorogenes được nuôi cấy trên thạch thường, sau 24 giờ nuôi trong tủ ấm 340C cho thấy: khuẩn lạc dạng R, đường kính khoảng 4 – 4,5 mm, hơi xám nâu, núm lồi dày.
Hình thái khuẩn lạc Chủng L. sprorogenes được minh họa trong hình 3.1.
3.1.1.2. Hình thái tế bào
Sau khi nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi có nhỏ giọt dầu với độ phóng đại 100 lần ta thấy: L. sprorogenes là trực khuẩn Gram (+), tế bào hình que, kích thước khoảng 1,5 x 1 µm, 2 đầu tù, vỏ và 2 đầu bắt màu đậm, có sinh bào tử.
Hình thái tế bào chủng L. sprorogenes được minh họa trong hình 3.2
Hình 3.2: Hình thái tế bào của chủng L. sprorogene
3.1.1.3. Tính chất nuôi cấy
Sau khi nuôi cấy chủng L. sprorogenes trên canh thang ở 340C, pH = 7,2: Sau 6 – 8 giờ nuôi cấy tạo váng mỏng nhẹ, màu trắng trên bề mặt canh thang. Sau 18 – 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo váng dày, lắc nhẹ bị vỡ ra và rơi xuống, làm môi trường đục nhẹ và trắng, đáy ống có lắng cặn màu trắng.
3.1.2. Đặc điểm sinh hóa 3.1.2.1. Khả năng đông sữa 3.1.2.1. Khả năng đông sữa
Sau khi nuôi cấy chủng L. sprorogenes ở 340C trong môi trường sữa có chứa kháng sinh: sau 16 giờ ta thấy dung dich trong ống nghiệm bắt đầu đông tụ, còn ống nghiệm làm chứng đông tụ được khoảng ¼, sau 18 giờ ta thấy dung dịch trong ống nghiệm đông đặc được khoảng 1/3 còn ống nghiệm làm chứng đông tụ được 2/3, sau
24 giờ dung dịch trong ống nghiệm đông đặc đều đặn và một ít nước trên bề mặt. Vậy kết quả thí nghiệm đạt yêu cầu.
Từ 0 – 16 giờ dung dịch trong ống nghiệm chưa đông tụ sữa là do chủng L. sprorogenes đang thích nghi với môi trường và chịu sự ức chế của kháng sinh. Từ 16 – 24 giờ đung dịch trong ống nghiệm đều đông đặc hết do chủng L. sprorogenes có khả năng thoát khỏi sự ức chế của kháng sinh và sinh ra acid lactic làm pH của môi trường giảm xuống dẫn đến casein trong sữa đông tụ (điểm đẳng điện của casein là 5,1 – 5,3 ) làm cho dung dịch trong ống nghiệm đông đặc.
Vậy chủng L. sprorogenes có khả năng sinh ra acid lactic và thoát khỏi sự ức chế của kháng sinh.
3.1.2.2. Khả năng kháng kháng sinh
Sau khi 24 giờ nuôi cấy chủng L. sprorogene trên môi đặc ở 340C có đặt các khoanh giấy kháng sinh cho ta kết quả sau:
Bảng 3.1: Độ nhạy cảm với kháng sinh của chủng L. sprorogene
TIÊU CHUẨN (mm) TT KHÁNG SINH ĐƯỜNG KÍNH VÒNG ỨC CHẾ (TB ± 1) kháng (R) Trung gian (I) Nhạy (S) KẾT QUẢ 1 Penicilline 10 < 8 8-29 > 29 I 2 Amoxcilline 15 < 14 14-21 > 21 I 3 Methicilline 10 < 20 > 20 R 4 Oxacillin 8 < 20 > 20 R 5 Cephalothin 15 < 12 12-18 > 18 I 6 Cephalexin 25 < 12 12-18 > 18 S 7 Cefotaxime 11 < 15 15-21 > 21 R 8 Vancomycin 21 < 17 > 17 S 9 Polymyxine 8 < 15 > 15 R 10 Kanamycin 19 <15 15-17 >17 S 11 Lincomycin 16 <17 17-21 >21 R 12 Erythromycine 24 <17 17-22 >22 S 13 Chloramphenicol 25 <19 19-23 >23 S 14 Tetracycline 26 <17 17-19 >19 S 15 Bactrim 0 < 10 10-16 > 16 R 16 Ciprofloxacin 27 < 19 19-22 > 22 S
Kết quả tại Bảng 3.1, cho thấy chủng L. sprorogenes nhạy cảm mạnh với Tetracyline (vòng ức chế 26 mm vượt qua độ nhạy 7 mm), Ciprofloxacin (vòng ức chế 27mm vượt qua độ nhạy 5mm), Erythromycine (vòng ức chế 24 mm vượt qua độ nhạy 2 mm ), Chloramphenicol, Cephalexin (vòng ức chế 25 vượt qua độ nhạy 7 mm). Chủng L. sprorogenes nhạy cảm yếu với Oxacillin (vòng ức chế 8 mm mà chủng L. sprorogenes kháng được vòng ức chế 8 mm), Methicilline (vòng ức chế 10 cm mà chủng L. sprorogenes kháng được với vòng ức chế < 20 mm), tương tự cho Cefotaxime, Polymyxine, Lincomycin, Bactrim. Như vậy qua đây có thể thấy khi dùng men tiêu hóa có chứa chủng L. sprorogenes, không nên dùng chung với các loại kháng sinh nhạy cảm trên vì chúng ức chế mạnh với chủng L. sprorogenes như Tetracyline, Chloramphenicol, Ciprofloxacin …
3.2. Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng L. sprorogenes L. sprorogenes
3.2.1. Lựa chọn môi trường thích hợp nuôi cấy
Sau khi nuôi cấy chủng L. sprorogenes trên môi trường MRS, TSB, canh thang thường. Qua phép đo NTU, pH ở các thời điểm khác nhau ta xác định được sự sinh trưởng và phát triển của chủng L. sprorogenes được thể hiện qua hình 3.5.
. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 6 9 12 14 16 18 20 22 24 27 30 35 41 48 Thời gian N TU 0 1 2 3 4 5 6 7 8 p H
NTU MRS NTU TSB NTU CTT pH MRS pH TSB pH CTT (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.5: Khả năng sinh trưởng và phát triển chủng L. sprorogenes trên các môi trường khác nhau.
Qua kết quả nghiên cứu cho thấy chủng L. sprorogenes phát triển tốt nhất trên môi trường MRS vì đây là môi trường giàu dinh dưỡng. Chủng phát triển kém nhất trên canh thang thường, sau 24 giờ nuôi cấy NTU thấp chỉ được 178, số lượng tế bào chỉ đạt
2,8.108 nên không có khả năng ứng dụng để sản xuất chế phẩm. Vì vây môi trường MRS được chọn để nuôi cấy chủng L. sprorogenes.
Trong môi trường MRS: Khoảng thời gian từ 0 – 9 giờ độ đục tăng chậm (từ 5 – 145 NTU), pH môi trường giảm ít (từ 7,3 – 7,03) nên đây là khoảng thời gian chủng L. sprorogenes đang thích nghi với môi trường. Từ 9 – 16 giờ độ đục tăng nhanh(từ 145 – 786 NTU), pH môi trường giảm nhanh (từ 7,03 – 5,89) chứng tỏ đây là khoảng thời gian chủng L. sprorogenes sinh trưởng và phát triển mạnh. Từ 16 – 24 giờ độ đục tăng chậm, pH giảm chậm và sau đó độ đục và pH hầu như không thây đổi, vậy đây là khoảng thời gian chủng đã ngừng phát triển.
Trong môi trường TSB: Khoảng thời gian 0 –16 giờ độ đục tăng chậm (từ 3 – 163 NTU), pH giảm ít (từ 7,3 – 6,87) vậy đây là khoảng thời gian chủng L. sprorogenes thích nghi với môi trường. Từ 16 – 22 giờ độ đục tăng nhanh (từ 163 – 492 NTU), pH giảm mạnh (từ 6,87 – 6,05) chứng tỏ đây là khoảng thời gian chủng L. sprorogenes sinh trưởng và phát triển mạnh. Sau 22 giờ độ đuc và pH tương đối ổn định, chứng tỏ chủng L. sprorogenes đã ngừng phát triển.
Trong môi trường canh thang thường: Khoảng thời gian 0 – 16 giờ độ đục tăng chậm (1 – 68 NTU), pH giảm ít (7,3 – 7,08) vậy đây là khoảng thời gian chủng L. sprorogenes thích nghi với môi trường. Từ 16 – 20 giờ độ đục tăng nhanh (từ 68 – 166 NTU), pH giảm mạnh (từ 7,08 – 6,7) chứng tỏ đây là khoảng thời gian chủng L. sprorogenes sinh trưởng và phát triển mạnh. Sau 20 giờ độ đục và pH hầu như không thay đổi, chứng tỏ chủng L. sprorogenes đã ngừng phát triển.
3.2.2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
Bảng 3.2: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng L. sprorogenes.
24 giờ 48 giờ
Thời gian
Nhiệt độ NTU CFU/ml pH NTU CFU/ml pH
280C 825 1,3.1012 5,37 806 1,7.1012 5,4 340C 847 3,3.1012 5,31 837 4,1.1012 5,3
Kết quả nghiên cứu cho thấy: ở nhiệt độ từ 28 – 340C, chủng L.sprorogenes
phát triển rất tốt, sau khi lên men 24 giờ đạt 1012 CFU/ml và thay đổi không đáng kể sau 48 giờ nuôi cây. Ở nhiệt độ 370C, khả năng lên men của chủng L.sprorogenes là yếu hơn, sau 24 giờ nuôi cấy chỉ đạt 1011 CFU/ml.
Như vậy, nhiệt độ lên men thích hợp đối với chủng L.sprorogenes là khoảng 28 – 340C, tuy nhiên ở 340C cho kết quả tốt hơn. Vậy chúng tôi chọn nhiệt độ lên men là 340C.
3.2.3. pH nuôi cấy thích hợp
Bảng 3.3: Kết quả ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và phát triển của L. sprorogenes
24 giờ 48 giờ
Thời gian pH
NTU CFU/ml NTU CFU/ml
5,5 15 2,7.107 17 3,2.107 5,8 22 1,3.108 21 1,1.108 6,1 150 1,7.1010 148 1,3.1010 6,4 170 7,0.1010 172 5,5.1010 6,7 440 7,2.1011 441 6,5.1011 7,0 674 1,7.1012 676 1,8.1012 7,3 873 2,3.1012 870 1,9.1012 7,6 643 1,8.1012 645 1,3.1012 7,9 587 1,2.1012 586 9,9.1011 8,2 486 7,3.1011 489 6,5.1011 8,5 459 5,4.1011 462 4,6.1011
Qua kết quả nghiên cứu cho thấy khoảng pH phát triển tốt nhất của chủng
L. Sprorogenes là 7,0 – 7,9 (sau 24 giờ nuôi cấy NTU đạt được khoảng 587 – 674, độ sống đạt 1011 – 1012 CFU/ml). Trong đó, pH tối ứu cho chủng L. sprorogenes là 7,3
(sau 24 giờ nuôi cấy NTU đạt 873, số lượng tế bào đạt 2,3.1012 CFU/ml). pH chủng L. sprorogenes phát triển kém nhất là 5,5 – 5,8 (sau 24 giờ nuôi cấy số lượng tế bào chỉ đạt 107 – 108 CFU/ml, NTU rất thấp khoảng 15 - 22).
Vậy pH lên men thích hợp với chủng L. sprorogenes là khoảng 7,0 – 7,9, trong đó ở pH = 7,3 cho kết quả tốt nhất. Nên chúng tôi chọn pH lên men là 7,3.
3.2.4. Nghiên cứu thời gian nhân giống thích hợp
Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu thời gian nhân giống thích hợp của chủng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
L. sprorogenes Chỉ số Thời gian NTU CFU/ml pH 16h 789 4,7.1012 5,9 20h 823 2,3.1012 5,46 24h 813 2,8.1012 5,27
Qua kết quả nghiên cứu cho thấy: Thời gian nhân giống 16h, 20h, 24h không có sự chênh lệch nhiều đến sinh khối cũng như độ sống của tế bào. Trong đó, giống được nuôi sau 16h cho kết quả tốt nhất ( 4,7.1012 CFU/ml ). Vì vậy, trong sản xuất ta áp dụng chế độ nhân giống 16h vừa hiệu quả vừa rút ngắn thời gian sản xuất.
3.2.5. Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy
Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy lên sự sinh trưởng và phát triển L. sprorogenes
24 giờ 48 giờ
Thời gian % giống
NTU CFU/ml pH NTU CFU/ml pH
5% 706 1,2.1012 5,14 694 1,7.1012 5,32
7,5% 780 1,8.1012 5,2 735 1,4.1012 5,35
Qua kết quả nghiên cứu ta nhận thấy: Tỷ lệ giống từ 5% đến 10% đều cho kết quả tốt và chênh lệch không nhiều, đều đạt độ sống 1012 CFU/ml. Vì vậy để sản xuất chế phẩm chúng ta nên chọn tỷ lệ tiếp giống là 5% cho kinh tế.
3.2.6. Nghiên cứu thời gian nuôi cấy thích hợp
Bảng 3.6: Kết quả nghiên cứu thời gian nuôi cấy thích hợp của chủng L. sprorogenes Chỉ số Thời gian NTU CFU/ml pH 24h 845 5,2.1012 5,24 36h 831 4,3.1012 5,29 48h 838 2,8.1012 5,26
Từ kết quả nghiên cứu ta thấy thời gian lên men trong khoảng 24 – 48 giờ cũng không ảnh hưởng nhiều đến sinh khối, độ sống của tế bào. Dịch lên men cũng đạt 1012 CFU/ml, tuy nhiên thời gian nuôi cấy 24 giờ cho kết quả tốt nhất ( 5,2.1012 CFU/ml ). Vì vậy, chọn thời gian lên men là 24 giờ vừa rút gọn thời gian nuôi cấy, vừa giảm chi phí sản xuất.
CHƯƠNG 4
4.1. Kết luận.
4.1.1. Một số đặc điểm sinh học của chủng L. sprorogenes như sau: 4.1.1.1. Hình thái và tính chất nuôi cấy
L. sprorogenes là trực khuẩn Gram (+), có sinh bào tử, khuẩn lạc dạng R, tạo váng trên bề mặt môi trường, làm đục nhẹ môi trường.
4.1.1.2.Đặc điểm sinh hóa
Có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh như: Oxacilin, Tpimethoprin, Polymixin
Có khả năng làm đông sữa ngay cả khi có mặt kháng sinh
4.1.2. Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng L. sprorogenes cho kết quả sau:
Môi trường lên men là môi trường MRS Nhiệt độ lên men : 340C
pH lên men: 7,3
Tỷ lệ nhân giống cấy: 5% Thời gian nhân giống : 16h Thời gian nuôi cấy : 24h – 48h
4.2. Đề xuất ý kiến
Đây là men tiêu hóa sống, nên cần đảm bảo được độ sống của chủng vi sinh trong thời hạn sử dụng. Vì vậy, cần nghiên cứu thêm một số điều kiện để đảm bảo độ sống của chủng vi sinh vật như: nghiên cứu một số điều kiện để tạo thành lượng bào tử nhiều hơn … (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiếp tục nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng L. sprorogenes để áp dụng vào sản xuất trên thiết bị lên men.
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1] Nguyễn Lân Dũng , Nguyễn Đình Quyết, Phạm Văn Tý, (2003), Vi sinh vật học, Nhà xb Giáo dục, tr 25- 38, tr 221- 228.
[2] Lê Thị Loan, (2005), Nghiên cứu một số đặc tính sinh hoá miễn dịch và sinh học phân tử của các chủng probiotic thuộc chi Bacillus subtilis dùng trong sản xuấtsinh phẩm tại viện vacxin, Luận án tiến sĩ y học, Cơ sỡ đào tạo sau Đại học viện vệ sinh dịch tễ trung ương Hà Nội, tr 34- 37.
[3] Trần Duy Thiết, ( 2004 ), Nghiên cứu ứng dụng chủng Lactobacillus acidophilus trong sản xuất chế phẩm sinh học dùng phòng và trị bệnh nuôi tôm cá, Luận văn tốt nghiệp Đại học Thuỷ Sản. tr 5- 12, tr 33- 38.
[4] PGS – PTS. Trần Thị Luyến, (1998), Công nghệ chế biến các sản phẩm lên men, Nhà xb Nông Nghiệp.
[5] La Văn Vị, Vi sinh vật với kháng sinh, tiểu luận, Đại học Đà Lạt, tháng 8/1996
[6] Hồ sơ xin đăng ký BIOLAC, ( 1997 ).
[7] Nguyễn Thị Xuyến, Thực tập vi sinh vật, Trường đại học Nha Trang, tr 38- 39, tr 42- 43.
[8] PGS – TS. Lương Đức Phẩm, (1998), Hoá sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
[9] Trần Văn Du, (1990), Báo cáo tổng kết đề tài, Nghiên cứu quy trình sản xuất Baccilus subtilis dưới dạng bột khô tên gọi Sbtylac.
[10] Trần Thị Kim Hoa, (1984), Bước đầu sử dụng Biosubtyl trong điều trị ở bệnh viện đa khoa Lâm Đồng, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Đà Lạt.
[11] Vũ Văn Ngũ, (1981), Loạn khuẩn đường ruột và tác dụng điều trị của Colisubtyl, Bệnh viện Bạch Mai – Hà Nội.
[12] Vũ Văn Ngũ, (1980), Vi khuẩn chí ở ruột – vai trò sinh lý và nguyên nhânloạn khuẩn, Bệnh viện Bạch Mai – Hà Nội.
[13] Lương Đức Phẩm - Hồ Sưởng, (1978), Vi sinh tổng hợp, Nhà xb Khoa học và Kỹ thuật – Hà Nội.
[14] Vấn đề loạn khuẩn về mặt lâm sàng, Bệnh khoa truyền nhiễm số 2, thành phó Matxcơva - Tuyển tập công trình nghiên cứu số 2, (tài liệu dịch).
2. TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[15] Microbiology Mannal 12th Edition.
[16] Instruction Manual, tr 4.1 – 4.5
3. TÀI LIỆU INTERNET
[18] BS. Bùi Xuân Vĩnh, Lại nói về tiêu chảy trẻ em (2007)
http:// www.ykhoanet.com/SKDS/NHIKHOA/56-02.htm
[19] G.Dreyfuss, Bệnh tiêu chảy của khách du lịch
http://203.162.1.204/tapchi/sottyd/nam2000/bai5-2-2000.htm [20] Thái Hằng, Viện nhi qúa tải vì bệnh tiêu chảy
http://www1.dantri.com.vn/suckhoe/2007/1/166067.vip [21] Nguyên nhân và phương pháp điều trị bệnh tiêu chảy
http://www.suckhoe360.com/Me-va-be-yeu/Tieu-hoa/Phong-benh-tieu-chay- do-rotavirus.php
[22] N.Phương, 56% Trẻ tiêu chảy do nhiễm Rotavirus (2007) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
http://www.suckhoedoisong.vn/details.asp?Object=25634433&News_ID=795 9883 [23]http://www.biopharco2.com.vn/vietnamese/frame.php?page=det ail.php&pid=34 [24]http://www.imexpharm.com/chitietSP.asp?MASP=78 [25]http://www.pasteur-hcm.org.vn/vacxin_sp/mentieuhoa.htm [26] Antibio – 75mg, http://duocphamyte.com/pharmas/thuoc-tieu-hoa/ho-tro-tieu-hoa/D4042 [27] Lactomin plus (3 loại vi khuẩn lactic được bảo vệ bằng bao phím),
http://www.austrapharmvn.com/vietnam/product.php?id=19 [28] L – BIO
http://www.austrapharmvn.com/vietnam/product.php?id=16 [31] Hồng Hải, (2006), Phòng bệnh tiêu chảy mùa đông
http://www1.dantri.com.vn/suckhoe/2006/11/149937.vip [32] BS. Nguyễn Văn Dũng, (2007), Tiêu chảy cấp ở người cao tuổi
http://www.khoahoc.com.vn/view.asp?Cat_ID=6&Cat_Sub_ID=5&news_id=1 6272
[33] BS.ThS. Bùi Thanh Tuấn, Hiệu quả bổ sung sữa đậu nành trong dự phòng bệnh tiêu chảy ở trẻ em 6 – 24 thánh tuổi
http://www.ctu.edu.vn/workshop/hnkh-y11/yhanoi/yhn8..htm [34] http://www.lactospore.com/back2.htm
PHỤ LỤC
Bảng 6.1: Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng L. sprorogenes trên các môi trường khác nhau. NTU pH Thời gian MRS TSB CTT MRS TSB CTT 0 5 3 1 7,3 7,3 7,3 6 87 24 9 7,2 7,26 7,28 9 145 78 24 7,03 7,18 7,19 12 372 102 36 6,83 7,05 7,16 14 675 114 40 6,47 6,98 7,12 16 786 163 68 5,89 6,87 7,08 18 807 316 111 5,7 6,41 6,84 20 835 411 166 5,6 6,23 6,7 22 852 492 170 5,58 6,05 6,7 24 873 506 178 5,5 6,02 6,7 27 869 499 175 5,5 6,0 6,69 30 870 497 175 5,5 6,0 6,7 35 868 496 174 5,5 6,0 6,68 41 865 495 175 4,96 6,0 6,7 48 864 495 175 4,95 6,0 6,7