- Máy đo NTU. - Cân điện tử. - Máy đo pH. - Kính hiển vi. - Máy khuấy từ.
- Tủ ấm, tủ sấy, nồi tiệt trùng, tủ lạnh, bếp điện, box cấy - Các dụng cụ thông thường trong nghiên cứu vi sinh vật + Hộp lồng petri
+ Ống nghiệm, bình nón có nút bông + Pipet man vô trùng
+ Que trang thủy tinh, que cấy
2.1.3. Hóa chất
- Pepton ( Trung Quốc ). - Tween ( Anh ).
- Đường: Glucose …
- Các loại muối: CH3COONa, MgSO4, Mn3(PO4), (NH3)2C6H5O7, NaCl … - Nước cất, cồn và các hóa chất khác. 2.1.4. Môi trường 2.1.4.1. Môi trường MRS (g/l) - Pepton 10 - Cao thịt 8 - Cao men 10 - Glucose 20 - K2HPO4 2 - Tween 80 1
- NH4NO3 2 - CH3COONa 5 - MgSO4 0,2 - MnSO4 0,04 - Nước cất 1000ml - pH = 6
- Sau khi pha môi trường thì môi trường được đem xuống Phòng Môi Trường hấp 1210C/15 phút. 2.1.4.2. Môi trường TSB (g/l) - Casein Peptone 17,0 - Soya Peptone 3,0 - (NH4)2HPO4 5,0 - Glucose 2,5 - Nước cất 1000ml - pH = 7,3 ± 0,2
- Sau khi pha môi trường thì môi trường được đem xuống Phòng Môi Trường hấp 1210C/15 phút
2.1.4.3. Môi trường canh thang thường (g/l)
- Peptones 15,0 - Cao men 3,0 - NaCl 6,0 - Glucose 1,0 - agar – agar 12,0 - Nước cất 1000ml - pH = 7,5± 0,2
- Sau khi pha môi trường thì môi trường được đem xuống Phòng Môi Trường hấp 1210C/15 phút
2.1.5. Pha các dung dịch 2.1.5.1. Dung dịch NaOH
Dung dịch NaOH được pha với nồng độ 10% ( 40g NaOH pha thành 400 ml dung dịch NaOH ), sau đó phân vào các bình tam giác thể tích 250 ml, mỗi bình 200 ml, tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút.
2.1.5.2. Dung dịch HCl
Dung dịch HCl được pha với nồng độ 10% ( 40g HCl pha thành 400 ml dung dịch HCl ), sau đó phân vào các bình tam giác thể tích 250 ml, mỗi bình 200 ml, tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn để quan sát hình thái chủng L.
sprorogenes
Để nghiên cứu đặc điểm hình thái của tế bào vi khuẩn, ta nuôi cấy chủng
L. Sprorogenes trên môi trường đặc trong 24 giờ hoặc 6 – 8 giờ trên môi trường canh thang, tiến hành làm tiêu bản và nhuộm Gram với các dung dịch sau:
- Tím gentian
Tím gentian dung dịch bão hoà trong cồn 950C: 10ml Acid phenic: 1ml Nước cất : 100ml Lắc đều lọc qua giấy lọc
- Fuchsin kiềm
Fuchsin kiềm dung dịch bão hoà trong cồn 950C: 10ml Acid phenic: 5ml Nước cất: 100ml Lắc đều lọc qua giấy lọc.
- Dung dịch Lugol Iod: 1 g KI: 2 g Nước: 50ml
Nghiền trong cối rồi đem nước cất đủ 200ml - Cồn 950C
Cách làm tiêu bản như sau:
+ Dùng que cấy lấy từ 1 đến 2 giọt canh trường có chứa vi khuẩn cần quan sát bôi lên phiến kính
+ Dàn và cố định tiêu bản trên ngọn đèn cồn
+ Nhỏ tím gentian lên tiêu bản, để 30 giây, rửa nước + Nhỏ Lugol, để 30 giây
+ Nhỏ cồn cho đến khi thấy tiêu bản có màu xanh nhạt + Nhỏ Fuchsin kiêm, để 30 giây, rửa nước
+ Để khô soi tiêu bản bằng vật kính dầu (x100)
Kết quả: Nếu tế bào vi khuẩn nhuộm bắt màu tím là vi khuẩn Gram dương (G+), nếu bắt màu hồng là vi khuẩn Gram âm (G+).
Tính chất nuôi cấy: quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường canh thang pH = 7,2 và trên môi trường thạch dinh dưỡng pH = 7,2.
2.2.2. Phương pháp kiểm tra độ sống tế bào (CFU – Colony Forming Unit)
Môi trường được sử dụng là môi trương MRS Các bước tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch nuôi cấy đưa sang ống nghiệm chứa 9 ml NaCl 0,85% ( nước muối sinh lý ). Tiếp tục pha loãng để có được các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4, …
Chuẩn bị môi trường thạch đĩa: Môi trường MRS có bổ sung thêm 1,5 - 2% thạch, khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Đợi nguội đến 45 ÷ 500C bổ sung thêm 2 % Glucose rồi đổ vào các hộp Petri vô trùng. Chờ thạch đông và sấy khô mặt thạch.
Cấy và dàn đều dịch pha loãng: Dùng Pipet Man với đầu côn vô trùng lấy từ các độ pha loãng trên nhỏ vào các hộp Peptri có chứa thạch, mỗi hộp Peptri nhỏ 0,1 ÷ 0,3 ml. Mỗi độ pha loãng được lặp lai 3 lần. Dùng que trang thuỷ tinh vô trùng dàn đều dịch tế bào lên khắp bề mặt thạch.
Các bước phải được thực hiện trong box cấy vô trùng Các bước thao tác được minh hoạ trong hình
Hình 2.1: Sơ đồ pha loãng và cấy mẫu
Nuôi và đếm số khuẩn lạc: Các hộp Peptri đã được cấy dịch tế bào, gói kín bằng giấy báo vô trùng và để ngược trong tủ ấm 340C, trong thời gian 2 ngày. Đếm số khuẩn lạc trong mỗi hộp Peptri.
Tính kết quả: Khi nồng độ pha loãng giảm 10 lần, số khuẩn lạc trên đĩa cũng giảm xấp xỉ 10 lần và trên 2 đĩa có cùng đĩa pha loãng chỉ chênh lệch 10% thì chứng tỏ việc tách rời các tế bào, pha loãng cũng như dàn đều chúng trên mặt thạch diễn ra hoàn hảo và kết quả thu được là đáng tin cậy.
Một khuẩn lạc có thể được hình thành từ một, vài hoặc nhiều tế bào (đối với vi khuẩn thì thường là từ một tế bào). Từ số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch có thể suy ra số lượng tế bào (CFU) trong mẫu một cách tương đổi.
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 0,1 ml 0,1 ml Mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
CFU/ml(g) = a × 1/K × 1/V. [7, tr 41]
a: Số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên các đĩa cấy có cùng độ pha loãng K: Độ pha loãng của dịch nuôi cấy
V: Thể tích dịch pha loãng được cấy gạt trên mặt đĩa thạch (ml)
2.2.3. Xác định nồng độ tế bào bằng phương pháp đo NTU
Khi sinh trưởng và phát triển trong môi trường lỏng các tế bào vi sinh vật có thể làm đục môi trường. Tính chất này được biểu thị bằng thuật ngữ “độ đục” và sử dụng đánh giá gián tiếp số lượng tế bào. Hiện nay phương pháp xác định nồng độ tế bào bằng phương pháp đo NTU đang được sử dụng. Cơ sở phương pháp này là tính chất làm lệch một phần ánh sáng của dung dịch có vật lơ lửng.
Lấy 20 ml dịch nuôi cấy để tiến hành đo NTU. Đối với mẫu chứng là mẫu chuẩn có NTU =0.
Hình 2.2: Máy đo độ đục
2.2.4. Xác định khả năng kháng kháng sinh
Đổ thạch thường vào đĩa Peptri sao cho bề dày của thạch khoảng 3,5 – 4 mm. Sau đó, phơi thạch trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Dùng pipet vô trùng cho vào đĩa thạch 0,5 – 1 ml dung dịch huyền phù có chứa chủng L. Sprorogenes (dung dịch huyền phù cứa chủng L. Sprorogenes được nuôi cấysau 6 – 8 giờ), dùng que trang thuỷ tinh
dàn đều dịch huyền phù trên mặt thạch. Đĩa Peptri đặt vào tủ ấm 340C trong 40 – 60 phút cho se mặt thạch, đặt giấy kháng sinh vào, giữ nhiệt độ phòng 30 phút để khuyếch tán kháng sinh, nuôi cấy tiếp 340C. Đọc kết quả bằng cách đo vòng ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau 24h nuôi cấy.
Hình 2.3: Sơ đồ đặt giấy kháng sinh vào đĩa thạch
2.2.5. Thử độ đông sữa
Cho vào 7 ống nghiệm, mỗi ống 5ml sữa vô trùng và lắc đều với 0,5 ml dung dịch huyền phù có chứa chủng L. Sprorogenes (dung dịch huyền phù chứa chủng
L. Sprorogenes được nuôi cấysau 6 – 8 giờ). Cho vào mỗi ống nghiệm 2 cái mẫu tròn chứa kháng sinh ức chế trong số 6 loại sau: Amoxylin, Cefalexin, Tetramyline, Polymicin, Vancomycin, Kanamycin. Trong đó 6 ống nghiệm có chứa kháng sinh, còn 1 ống nghiệm dùng làm chứng.
Sản phẩm coi như đạt yêu cầu, nếu như trong thời gian ủ ấm, dung dịch trong ống nghiệm đông đặc đều đặn và một ít phần nước trong ở trên.
2.2.6. Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng Lac. sprorogenes
2.2.6.1. Lựa chọn môi trường thích hợp nuôi cấy
Đặc điểm của chủng L. sprorogenes nói riêng và của loài Lactobacillus nói chung là thành phần dinh dưỡng khá phức tạp. Việc lựa chọn môi trường dinh dưỡng phù hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của chúng là rất quan trọng để thu được lượng sinh khối tối đa.
Tiến hành nuôi cấy chủng L. sprorogenes trên các môi trường nuôi cấy khác nhau (môi trường MRS, TSB, canh thang thường), lượng môi trường chiếm 2/3 thể tích bình nuôi cấy, pH trước lúc nuôi cấy được chỉnh là 7,3. Nuôi trong điều kiện tĩnh ở nhiệt độ 340C, khả năng sinh trưởng và phát triển chủng được theo dõi bằng phép đo NTU, độ sống (CFU/ml) và pH. Kết quả được đánh giá qua các thời gian nuôi cấy sau: 0, 6, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 27, 30, 35, 41, 48 trên các môi trường lỏng MRS, TSB, canh thang thường.
2.2.6.2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết quả của các phản ứng hoá học. Các phản ứng hoá học lại phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ vì thế yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sinh sống tế bào. Mỗi loài vi sinh vật chỉ có thể họat động trong giới hạn nhiệt độ nhất định. Để nuôi cấy vi sinh vật thì việc nghiên cứu để tìm ra nhiệt độ tối thích cho quá trình lên men có ý nghĩa cực kỳ quan trọng.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng
L. sprorogenes được thực hiện trên môi trường MRS. Cấy chủng vào môi trường với lượng khoảng 2/3 thể tích bình nuôi cấy, sau đó để ở các nhiệt độ khác nhau. Kết quả được đánh giá qua: phép đo NTU, độ sống (CFU/ml), pH sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy trên môi trường lỏng MRS.
2.2.6.3. pH nuôi cấy thích hợp
pH môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sinh trưởng và phát triển của nhiều loại vi sinh vật. Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion, nhưng biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng đều ảnh hưởng rất mạnh đến tế bào vi sinh vật. Cho nên việc xác định pH thích hợp cho tế bào vi sinh vật được tiến
hành trên môi trường MRS, nhiệt độ nuôi cấy 340C. Cấy chủng vào môi trường, sau đó để các giá trị pH: 5,5; 5,8; 6,1; 6,4; 6,7; 7,0; 7,3; 7,6; 7,9; 8,2; 8,5. Kết quả được đánh giá qua phép đo NTU, độ sống (CFU/ml) sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy trên môi trường lỏng MRS.
Hình 2.4: Máy đo pH
2.2.6.4. Nghiên cứu thời gian nhân giống thích hợp
Việc nghiên cứu thời gian nhân giống thích hợp có tác dụng rút ngắn thời gian của quá trình sản xuất, nâng cao hiệu quả kinh tế, giảm giá thành sản phẩm. Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường MRS, pH = 7,3 và nhiệt độ 340C. Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của chủng giống được phân trong thời gian: 16h, 20h, 24h. Kết quả được đánh giá qua: NTU; CFU/ml; pH.
2.2.6.5. Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy
Được thực hiện trên môi trường MRS, nhiệt độ 340C và pH = 7,3. Lượng môi trường chiếm 2/3 thể tích bình nuôi cấy. Giống được bổ sung tỷ lệ 5%; 7,5%; 10% theo thể tích môi trường nuôi cấy. Nuôi trong tủ ấm 340C, pH = 7,3. Theo dõi sự phát triển của chủng trong 24 giờ, 48 giờ. Kết quả được đánh giá thông qua chỉ số NTU, độ sống (CFU/ml), pH.
2.2.6.6. Nghiên cứu thời gian nuôi cấy thích hợp
Trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm việc xác định thời gian thu sinh khối có vai trò quan trọng, nó không chỉ có ý nghĩa trong việc rút ngăn thời gian sản xuất mà còn ảnh hưởng tới chất lượng của chế phẩm sau này. Thực hiện nuôi cấy tĩnh trong tủ ấm với môi trường MRS, nhiệt độ 340C, pH = 7,3 và tỷ lệ giống đã là 5%. Theo dõi kết quả sau: 24h, 36h, 48h. Kết quả được đánh giá qua: NTU; CFU/ml; pH.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng L. sprorogenes 3.1.1. Hình thái thái tế bào và tính chất nuôi cấy 3.1.1. Hình thái thái tế bào và tính chất nuôi cấy
3.1.1.1. Hình thái khuẩn lạc
Chủng L. sprorogenes được nuôi cấy trên thạch thường, sau 24 giờ nuôi trong tủ ấm 340C cho thấy: khuẩn lạc dạng R, đường kính khoảng 4 – 4,5 mm, hơi xám nâu, núm lồi dày.
Hình thái khuẩn lạc Chủng L. sprorogenes được minh họa trong hình 3.1.
3.1.1.2. Hình thái tế bào
Sau khi nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi có nhỏ giọt dầu với độ phóng đại 100 lần ta thấy: L. sprorogenes là trực khuẩn Gram (+), tế bào hình que, kích thước khoảng 1,5 x 1 µm, 2 đầu tù, vỏ và 2 đầu bắt màu đậm, có sinh bào tử.
Hình thái tế bào chủng L. sprorogenes được minh họa trong hình 3.2
Hình 3.2: Hình thái tế bào của chủng L. sprorogene
3.1.1.3. Tính chất nuôi cấy
Sau khi nuôi cấy chủng L. sprorogenes trên canh thang ở 340C, pH = 7,2: Sau 6 – 8 giờ nuôi cấy tạo váng mỏng nhẹ, màu trắng trên bề mặt canh thang. Sau 18 – 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo váng dày, lắc nhẹ bị vỡ ra và rơi xuống, làm môi trường đục nhẹ và trắng, đáy ống có lắng cặn màu trắng.
3.1.2. Đặc điểm sinh hóa 3.1.2.1. Khả năng đông sữa 3.1.2.1. Khả năng đông sữa
Sau khi nuôi cấy chủng L. sprorogenes ở 340C trong môi trường sữa có chứa kháng sinh: sau 16 giờ ta thấy dung dich trong ống nghiệm bắt đầu đông tụ, còn ống nghiệm làm chứng đông tụ được khoảng ¼, sau 18 giờ ta thấy dung dịch trong ống nghiệm đông đặc được khoảng 1/3 còn ống nghiệm làm chứng đông tụ được 2/3, sau
24 giờ dung dịch trong ống nghiệm đông đặc đều đặn và một ít nước trên bề mặt. Vậy kết quả thí nghiệm đạt yêu cầu.
Từ 0 – 16 giờ dung dịch trong ống nghiệm chưa đông tụ sữa là do chủng L. sprorogenes đang thích nghi với môi trường và chịu sự ức chế của kháng sinh. Từ 16 – 24 giờ đung dịch trong ống nghiệm đều đông đặc hết do chủng L. sprorogenes có khả năng thoát khỏi sự ức chế của kháng sinh và sinh ra acid lactic làm pH của môi trường giảm xuống dẫn đến casein trong sữa đông tụ (điểm đẳng điện của casein là 5,1 – 5,3 ) làm cho dung dịch trong ống nghiệm đông đặc.
Vậy chủng L. sprorogenes có khả năng sinh ra acid lactic và thoát khỏi sự ức chế của kháng sinh.
3.1.2.2. Khả năng kháng kháng sinh
Sau khi 24 giờ nuôi cấy chủng L. sprorogene trên môi đặc ở 340C có đặt các khoanh giấy kháng sinh cho ta kết quả sau:
Bảng 3.1: Độ nhạy cảm với kháng sinh của chủng L. sprorogene
TIÊU CHUẨN (mm) TT KHÁNG SINH ĐƯỜNG KÍNH VÒNG ỨC CHẾ (TB ± 1) kháng (R) Trung gian (I) Nhạy (S) KẾT QUẢ 1 Penicilline 10 < 8 8-29 > 29 I 2 Amoxcilline 15 < 14 14-21 > 21 I 3 Methicilline 10 < 20 > 20 R 4 Oxacillin 8 < 20 > 20 R 5 Cephalothin 15 < 12 12-18 > 18 I 6 Cephalexin 25 < 12 12-18 > 18 S 7 Cefotaxime 11 < 15 15-21 > 21 R 8 Vancomycin 21 < 17 > 17 S 9 Polymyxine 8 < 15 > 15 R 10 Kanamycin 19 <15 15-17 >17 S 11 Lincomycin 16 <17 17-21 >21 R 12 Erythromycine 24 <17 17-22 >22 S 13 Chloramphenicol 25 <19 19-23 >23 S 14 Tetracycline 26 <17 17-19 >19 S 15 Bactrim 0 < 10 10-16 > 16 R 16 Ciprofloxacin 27 < 19 19-22 > 22 S