Môi trường được sử dụng là môi trương MRS Các bước tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch nuôi cấy đưa sang ống nghiệm chứa 9 ml NaCl 0,85% ( nước muối sinh lý ). Tiếp tục pha loãng để có được các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4, …
Chuẩn bị môi trường thạch đĩa: Môi trường MRS có bổ sung thêm 1,5 - 2% thạch, khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Đợi nguội đến 45 ÷ 500C bổ sung thêm 2 % Glucose rồi đổ vào các hộp Petri vô trùng. Chờ thạch đông và sấy khô mặt thạch.
Cấy và dàn đều dịch pha loãng: Dùng Pipet Man với đầu côn vô trùng lấy từ các độ pha loãng trên nhỏ vào các hộp Peptri có chứa thạch, mỗi hộp Peptri nhỏ 0,1 ÷ 0,3 ml. Mỗi độ pha loãng được lặp lai 3 lần. Dùng que trang thuỷ tinh vô trùng dàn đều dịch tế bào lên khắp bề mặt thạch.
Các bước phải được thực hiện trong box cấy vô trùng Các bước thao tác được minh hoạ trong hình
Hình 2.1: Sơ đồ pha loãng và cấy mẫu
Nuôi và đếm số khuẩn lạc: Các hộp Peptri đã được cấy dịch tế bào, gói kín bằng giấy báo vô trùng và để ngược trong tủ ấm 340C, trong thời gian 2 ngày. Đếm số khuẩn lạc trong mỗi hộp Peptri.
Tính kết quả: Khi nồng độ pha loãng giảm 10 lần, số khuẩn lạc trên đĩa cũng giảm xấp xỉ 10 lần và trên 2 đĩa có cùng đĩa pha loãng chỉ chênh lệch 10% thì chứng tỏ việc tách rời các tế bào, pha loãng cũng như dàn đều chúng trên mặt thạch diễn ra hoàn hảo và kết quả thu được là đáng tin cậy.
Một khuẩn lạc có thể được hình thành từ một, vài hoặc nhiều tế bào (đối với vi khuẩn thì thường là từ một tế bào). Từ số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch có thể suy ra số lượng tế bào (CFU) trong mẫu một cách tương đổi.
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 0,1 ml 0,1 ml Mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
CFU/ml(g) = a × 1/K × 1/V. [7, tr 41]
a: Số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên các đĩa cấy có cùng độ pha loãng K: Độ pha loãng của dịch nuôi cấy
V: Thể tích dịch pha loãng được cấy gạt trên mặt đĩa thạch (ml)