PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

Điểm nóng chảy

Với các chất rắn việc xác định nhiệt độ nóng chảy là một yêu cầu cần thiết, vì nhiệt độ nóng chảy là một chỉ tiêu quan trọng để định tính và kiểm tra độ tinh khiết của một chất. Điểm nóng chảy đo trên máy Electrothermal IA 9000 series dùng mao quản, nhiệt kế không hiệu chỉnh.

Phổ hấp thu tử ngoại (UV):

Đo trên máy UV/Vis Spectrometer V530 (Shimadzu) tại Viện Công nghệ Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ hồng ngoại (IR):

Phổ IR được xác định bằng phương pháp dập viên KBr. Chất thử được trộn với KBr và nghiền mịn trên cối đá mã não, sau đó ép trên máy nén để tạo viên KBr. Phổ IR ghi trên máy quang phổ hồng ngoại IRVector 22 Bruker tại Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng  Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam

Phổ sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC):

Phổ HPLC được ghi trên hệ thống máy Sắc ký lỏng hiệu nâng cao HPLC Agilent tachnologies 1200 series DAD detector, cột Zorbac SBC18 1504.6 mm, kích thước hạt pha tĩnh 5 m made in USA

Máy sắc ký khí ghép khối phổ với độ phân giải cao (HRGC/HRMS)

Phổ HRMS được đo trên hệ thống máy HRGCHRMS AutoSpec Ultima NT của tập đòan WATERS  Mỹ

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 31 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR, 13CNMR được đo trên máy Bruker AM0 FTNMR Spectrometer (ghi ở 500 MHz cho phổ proton và ở 125MHz cho phổ 13

C), Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

IV TỔNG HỢP LUTEOLIN IV.1 Tổng hợp ở điều kiện thường

Chuẩn bị bình cầu 2L ba cổ, cho 6 g 9,8 mmol vào 600 mL H2O, lắp hệ thống đun hồi lưu kết hợp với khuấy cơ, đun nóng hỗn hợp, sau đó cho tiếp 21 mL dung dịch NaOH 32 tiếp tục đun cho hỗn hợp tan hoàn toàn, cuối cùng cho từ từ Na2S2O4 60 g, 0,34 mol vào. Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng, thời gian phản ứng 12h. Phản ứng kết thúc, làm lạnh hỗn hợp ở 5C, trung hoà hỗn hợp bằng HCl, kiểm tra bằng giấy chỉ thị pH pH4 VHCl  195 mL, khuấy hỗn hợp 1h. Lọc hỗn hợp ta thu được sản phẩm thô, sấy khô thu được 1,5905 g, hiệu suất 56,75. Xử lý sản phẩm thô bằng kết tinh nhiều lần trong aceton thu được sản phẩm sạch dạng bột, màu vàng 1,4808 g, hiệu suất 52,83, độ sạch đạt 93,52 .

Hình 2 Quy trình điều chế luteolin theo phương pháp thường IV.2 Tổng hợp trong lò vi sóng

Quy trình cũng tương tự như trên nhưng dùng bình cầu một cổ đặt bên trong lò vi sóng. Chỉnh công suất 300W, trong vòng 1h (20 phút x 3), có kết hợp với đun hồi lưu,

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 32 theo dõi phản ứng bằng chấm sắc ký bản mỏng. Dừng phản ứng và xử lý dung dịch tương tự như trên. So sánh hiệu suất với phương pháp thông thường.

Hình 3 Quy trình điều chế luteolin theo phương pháp có sử dụng lò vi sóng V TỔNG HỢP DẪN XUẤT CỦA LUTEOLIN

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 33

V.1 Tổng hợp dẫn xuất 3,4,5,7tetraacetoxyflavone (LAT)

Cho vào bình cầu 2 cổ 0,5 g luteolin (1,75 mmol) và 0,8 g sodium acetate, sau đó cho vào thêm 1,19 g (8,75 mmol) acetic anhidride. Dung dịch được đun hồi lưu, kết hợp với khuấy 20 phút. Sau đó đem đổ dung dịch vào hỗn hợp nước đá có khuấy đều, để yên cho các chất bột màu trắng lơ lửng lắng xuống. Lọc và rửa kết tủa thật sạch với nước lạnh trên phễu lọc buchner đến trung tính. Sản phẩm thu được đem sấy khô đến khối lượng không đổi. Ghi lại khối lượng thô, kết tinh sản phẩm thô nhiều lần trong aceton thu được sản phẩm sạch 0,423 g, hiệu suất 53,24, độ sạch đạt 90. O HO OH O OH OH O O O O O C C C C CH2 H H H O C C CH2 H H H C H2C H H H H C H H2C H O O O O O C C C CH3 O H3C O H3C O C O CH3 O O H3CO OCH3 O OCH3 OCH3 O HO OH O OH OH Br Br

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 34

Sơ đồ 1 Quy trình tổng hợp LAT V.2 Tổng hợp dẫn xuất 3,4,5,7tetrametoxyflavone (LMT)

Cho vào bình cầu hai cổ 0,5 g luteolin (1,75 mmol) cùng với 50 ml aceton, khuấy đều cho hoà tan hoàn toàn, sau đó cho thêm 5 g K2CO3 khan và nhỏ từ từ 1 g (7,9 mmol) dimetyl sulfat vào. Hỗn hợp được đun hồi lưu 10h, theo dõi phản ứng bằng chấm sắc ký bảng mỏng. Phản ứng kết thúc, lọc bỏ K2CO3, dịch qua lọc được cô loại dung môi. Phần rắn còn lại được rửa với nước, và đem sấy ta thu được sản phẩm thô. Kêt tinh sản phẩm thô nhiều lần với aceton thu được sản phẩm sạch 0,5428 g, hiệu suất 90,69, độ sạch đạt 99. Luteolin Ester hoá Cốc nước đá Lọc, rửa Sấy CH3COO Na Nước cất lạnh 3’, 4’, 5, 7- tetraacetoxyflavon thô (CH3CO)2 O

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 35

Sơ đồ 2 Quy trình tổng hợp LMT V.3 Tổng hợp dẫn xuất 3,4,5,7tetraallyloxyflavone (LAB)

Thực hiện phản ứng tổng hợp tương tự LMT với các tác nhân luteolin (0,5 g, 1,75 mmol) và allyl bromide (2,796 g, 0,0231mol), sau khi làm sạch qua sắc ký cột dung môi CHCl3 thu được sản phẩm sạch 0,5278 g, hiệu suất 67,62, độ sạch đạt 94.

V.4 Tổng hợp dẫn xuất 6,8dibromo3

,4,5,7tetrahydroxyflavone LTB

Luteolin (0.46 g, 1,61 mmol) được hoà tan trong bình cầu bằng 15 mL aceton. Hỗn hợp sau đó được làm lạnh bằng nước đá ở nhiệt độ 20C và cho tiếp hỗn hợp gồm oxon 2KHSO5.KHSO4.K2SO4 2,48 g, 4,039 mmol và KBr 0,48 g, 4,034mmol. Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng. Khi phản ứng kết thúc, lọc và cô loại dung môi, sau đó rửa bằng nước lạnh, thu được sản phẩm thô. Xử lý sản phẩm thô qua chạy cột với hệ dung

Cô quay chân không

Luteolin

Nước lạnh Kiểm tra pH

Bã (CH3)2SO4 K2CO3/ acetone Khuấy Lọc Làm đặc Lọc rửa Sấy khô Sản phẩm thô Ether hóa

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 36 môi CHCl3CH3OH 955 thu được sản phẩm dạng bột màu vàng cam 0.3005g, hiệu suất 42,04, độ sạch đạt 91.

Tất cả sản phẩm sau khi làm sạch được đo điểm nóng chảy và phân tích cấu trúc dựa vào phổ IR, HPLC, HRMS, 1HNMR, 13CNMR.

VI ĐO ĐỘ HẤP THU DPPH VI.1 Cơ sở thực nghiệm

Trong các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa, phương pháp đánh bắt gốc tự do 1,1diphenyl2picrylhydrazyl (DPPH) dùng để đánh giá rất phù hợp để khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các flavonoid, do các flavonoid khảo sát không hấp thu trong vùng hấp thu của DPPH. Hơn nữa sử dụng phương pháp này rất thuận lợi để nghiên cứu đánh giá mang tính sàng lọc và cho kết quả có tính khả thi sinh học tương đối cao. Phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH cũng được rất nhiều tác giả áp dụng để nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các flavonoid, vì phương pháp này so với các phương pháp khác, phương pháp đo DPPH có đặc điểm là khá đơn giản, rất thích hợp thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Nguyên tắc: Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế dập tắt

gốc tự do bằng phản ứng thuận nghịch giữa mẫu đo và DPPH sẽ làm giảm màu của dung dịch DPPH. Xác định khả năng này bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng có độ hấp thu cực đại tại 517 nm. 1,1diphenyl2picrylhydrazyl 1,1diphenyl2picrylhydrazine NO2 NO2 N N O2N + RH NO2 NO2 H N N O2N + R

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 37

VI.2 Dụng cụ và hóa chất

Rutin, quercetin, luteolin, LAT, LMT, LAB, LTB, DPPH, DMSO, ethanol. Bình định mức 10 ml, 250 ml, 500 ml, micropipette 1ml, 5ml, ống COD.

VI.3 Tiến hành thực nghiệm

Lần lượt pha các chất: rutin, quercetin, luteolin với 5 nồng độ khác nhau, LAT, LMT, LAB, LTB với 4 nồng độ khác nhau pha trong DMSO. Lấy 0,25 mL các mẫu thử trộn với 4,75 mL dung dịch DPPH nồng độ 200µM (pha trong ethanol) thu được dung dịch cuối cùng có nồng độ DPPH là 190µM và các mẫu thử tương ứng với sự thay đổi thể tích. Dung dịch được lắc đều và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó đem đo độ hấp thu của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 517nm để xác định khả năng bắt gốc tự do trên máy đo quang phổ DR2000 (Viện Công nghệ Hóa học). Mỗi mẫu đo 2 lần, lấy giá trị trung bình. Kết quả được tính theo công thức như đã nêu ở mục V.5.6, Tổng quan.

Giá trị SC50 được xác định như sau: Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ  khả năng bắt gốc tự do theo nồng độ khảo sát của chất cần thử nghiệm bằng phần mềm excel. Từ đồ thị nội suy ra giá trị nồng độ bắt 50 gốc tự do.

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 38

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 39

I Xác định cấu trúc của luteolin và dẫn xuất I.1 Xác định cấu trúc của luteolin

Thực hiện phản ứng với biện pháp chưng hồi lưu thông thường và phản ứng trong lò vi sóng cho kết quả như sau:

Bảng 1 So sánh phương pháp thường với phương pháp có sử dụng lò vi sóng

Phương pháp Khối lượng rutin (gram) Khối lượng sản phẩm thô (gram) Hiệu suất thô (%) Độ sạch tinh chế (%) Thời gian phản ứng (giờ) Đun hồi lưu thường 6 1,5905 56,75 93 12 Hồi lưu trong lò vi sóng 3 0,9445 67,15 97 1

Như vậy trong hai phương pháp được tiến hành thì phương pháp có sử dụng lò vi sóng đạt hiệu suất cao hơn, thời gian phản ứng ngắn hơn. Điều này là do nhiệt độ của lò vi sóng cao, kích thích các phân tử dao động mạnh hơn, nên khả năng phản ứng giữa các tác chất dễ xảy ra, và nhanh hơn.

- Sản phẩm thu được có dạng bột màu vàng, tnc300C t

nc= 330331C theo 47.

- Độ sạch  97 sắc ký đồ HPLC, phụ lục 2 

- Phổ UVVis đo trong methanol phụ lục 1 có ba mũi cực đại tại   347 nm,   267

nm và   253 nm.

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 40

- Phổ IR cm1 phụ lục 3 3505 cm1 OH, 31003000 cm1 CH , vòng thơm, 1655 cm1 CO liên kết hidro nội phân tử, 1611 cm1 giãn CC vòng thơm, 1267 cm1

giãn nhóm COH.

- Khối phổ HRMS phụ lục 4 cho thấy pic ion phân tử mz 309,0365 MNa tương ứng với công thức phân tử C15H10O6.

- Phổ 1HNMR DMSO,  ppm phụ lục 5, 13CNMR DMSO,  ppm phụ lục 6,7

- Phổ 1HNMR DMSO,  ppm cho tín hiệu tại 12,96 ppm là tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của proton nhóm OH tại C5 có liên kết hidro nội phân tử với O của nhóm cacbonyl tại C4 của hợp chất flavone. Tín hiệu tại 6,19 ppm 1H, d, J68  2Hz, H6 và 6,44 ppm 1H, d, J86  2Hz, H8 là của 2 proton vòng thơm ghép cặp vị trí meta với nhau ở vòng A của khung flavone. Tín hiệu tại 7,39 ppm 1H,d, J26  2,2 Hz, H2, 6,89 ppm 1H, d, J56  8,25 Hz, H5, 7,41 ppm 1H, dd, J62  2,2 Hz, và J65  8,25 Hz, H6, là 3 proton ghép cặp với nhau trên vòng B của khung flavone trong đó H2 và H6 ghép cặp ở vị trí meta, H5 và H6 ghép cặp ở vị trí ortho, kết quả này phù hợp với sự có mặt của hai nhóm OH gắn trên C3 và C4, tín hiệu tại 6,66 ppm 1H, s, H3, và tín hiệu 3 nhóm OH gắn vào các vị trí C7 10,79 ppm, C3 9,89 ppm , C4 9,38 ppm.

- Phổ 13CNMR DMSO,  ppm xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 15 cacbon trong đó có một C của CO 181,62 ppm ở vị trí C4 đồng thời chứng tỏ sự tồn tại của nối đôi C2 và C3 do nếu không có nối đôi thì độ dời hoá học của C4 tăng lên 197 ppm, 14

O O OH HO OH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6'

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 41 cacbon nằm ở vùng trường từ 93164 ppm gồm có 6CH  93,81 98,81 102,87 103,69 113,38 và 9 C bậc bốn  163,89 181,62 161,47 164,09 157,28 103,69 121,53 145,72 149,67. Kết quả được trình bày ở bảng

Bảng 2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất luteolin

Vị trí CH 1HNMR  ppm số H dạng mũi JHz 13CNMR  ppm 2 163,89 3 6,66 1H s 102,87 4 181,62 5 161,47 6 6,19 1H d J68  2Hz 98,81 7 164,09 8 6,44 1H d J86  2Hz 93,81 9 157,28 10 103,69 1 121,53 2 7,39 1H d J26  2,2 Hz 116,01 3 145,72 4 149,67

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 42 6 7,41 1H dd J62  2,2 Hz và J65  8,25 Hz 118,95 OH 5,7,3 ,4 12,96 10,79 9,89 9,38 Hình 5 Sản phẩm luteolin, TLC hệ CHCl3CH3OH  9010 Rf  0,33 I.2 Xác định cấu trúc của 3,4,5,7tetraacetoxyflavone (Ký hiệu LAT)

- Sản phẩm thu được có dạng hình kim màu trắng, tncC  223225C - Độ sạch đạt 90 sắc ký đồ HPLC, phụ lục 8.

- Phổ IR cm1 phụ lục 9 2938 (CH3), 3069 CH, vòng benzen, 1772 CO este, 1639 CO, 1373 OCOCH3, 1205 CO. So sánh với phổ IR của luteolin cho thấy phổ IR của LAT xuất hiện mũi mạnh ở 1772, điều này chứng tỏ sự xuất hiện của nhóm este CO ester.

- Khối phổ HRMS phụ lục 10 cho thấp pic ion phân tử mz 455,0999 MH tương ứng với công thức phân tử C23H18O10.

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 43 - Phổ 1HNMR DMSO,  ppm phụ lục 11, 12, 13CNMR DMSO,  ppm phụ lục 13, 14

Các giá trị phổ thu được cho thấy không có sự thay đổi nhiều về cấu trúc khung flavone. Trên phổ 1HNMR có sự xuất hiện thêm các tín hiệu proton của nhóm methyl CH3 2,322,51 ppm, không thấy sự xuất hiện các tín hiệu proton của nhóm OH Trên phổ 13CNMR xuất hiện thêm các tín hiệu cộng hưởng của C nhóm cacbonyl 167,90168,72 ppm, các tín hiệu cộng hưởng của C nhóm CH3 20,2520,81 ppm, đồng thời do ảnh hưởng của các nhóm CO nên các C ở các nhóm CH chuyển dời lệch về phía vùng trường thấp hơn, trong đó nhóm C6 và C8 bị lệch về phía trường thấp lớn nhất từ 1014 ppm, do ảnh hưởng của 2 nhóm CO gắn vào 2 vị trí C5 và C7, điều này cho thấy các nhóm OH đã bị thay thế hết. Và số lượng C xuất hiện trên phổ 13C là 23 phù hợp với công thức phân tử, phổ 1H cũng trùng khớp với công thức cấu tạo C23H18O10.

Từ các dữ liệu trên cho phép ta kết luận sản phẩm thu được là 3,4,5,7tetraacetoxyflavone (ký hiệu LAT)

Bảng 3 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất LAT

Vị trí CH 1HNMR  ppm số H dạng mũi JHz 13CNMR  ppm 2 156,99 3 6,95 1H s 114,23 O O O O O C C C O CH3 O H3C O H3C O C O CH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6'

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 44 5 153,91 6 7,09 1H d J68  2,5Hz 109,79 7 160,15 8 7,64  1H d J86  2,5Hz 108,30 9 149,37 10 114,36 1 129,09 2 8,04 1H d J26  2 Hz 121,87 3 142,50 4 144,77 5 7,50 1H d J56  9 Hz 124,48 6 8,05 1H dd J62  2 Hz, và J65  9 Hz 124,89 CH3 x 4 2,322,51 12H s 20,2520,81 Este CO x 4 167,90168,72

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 45

Hình 6 Sản phẩm LAT, TLC hệ CHCl3CH3OH  991 Rf  0,23 Bàn luận

- Do phenol không tham gia phản ứng ester hoá trực tiếp với acid carboxylic trong

điều kiện có xúc tác acid do hằng số cân bằng của phản ứng ester hoá giữa acid acetic và phenol rất nhỏ. Vì thế mà các ester của phenol được điều chế nhờ vào phản ứng ester hoá giữa phenol và các dẫn xuất của acid.

- Phản ứng ester hoá giữa phenol và acid anhydride có thể được tiến hành dễ dàng với sự có mặt của xúc tác acid hoặc trong môi trường kiềm.

- Trong môi trường kiềm yếu, luteolin chuyển thành dạng anion (ký hiệu ArO) có tính ái nhân mạnh hơn so với phenol, làm tăng khả năng tấn công vào nguyên tử carbon trong nhóm carbonyl của acid anhydride, phản ứng xảy ra theo cơ chế SN2