Một số chất chống oxy hóa

Trong cơ thể bình thường, những gốc tự do °OH, O2°, H2O2 vô cùng ít, các gốc tự do đã được một hệ thống các chất khử tự nhiên như: superoxid dismutase (SOD), glutathion (GSH), glutathion peroxidase (GSHPO), catalase bảo vệ, nên cơ thể chúng ta vẫn bình thường.

Các chất chống oxy hóa bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do bao gồm:

Trong tế bào:

- Superoxid dismutase (SOD): xúc tác cho phản ứng tạo ra nước từ O2°.

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 24

- Glutathion peroxidase (GSHPO), catalase: xúc tác phản ứng loại các peroxid.

Ngoài tế bào:

- Transferin, lactoferin: phức hóa Fe2+, ức chế phản ứng Fenton.

- Ceruloplasmin: khóa đồng ở dạng phức, ức chế sự tham gia của Cu2+, Fe2+ trong phản ứng peroxy hóa lipid ...

- Albumin: khóa Cu2+, Fe2+.

- Urat: loại °OH , liên kết với Cu2+, Fe2+.

- Vitamin E: loại LOO°, phá vỡ phản ứng mạch ở lipid.

- Vitamin C: trực tiếp loại O2° và gốc của oxy đơn bội ở pha nước, giúp tái tạo vitamin E khử.

Tuy nhiên theo thời gian và nhất là khi có các yếu tố bên ngoài tác động (vi khuẩn, tác nhân gây bệnh, chất độc, điều kiện sống...) thì gốc tự do tăng, các dạng oxy hoạt động tăng, khi đó, nếu chất chống oxy hóa giảm thì sẽ dẫn đến quá trình peroxy hóa lipid tăng.

Hậu quả là nhiều quá trình sinh hóa học biến đổi, gắn liền sau đó là tổn thương, viêm cấp, viêm mạn,... thậm chí có thể ung thư và chết.

V.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hoá 8, 14, 40, 42

Trong thực nghiệm, hoạt tính kháng oxy hóa được đo bằng khả năng bắt gốc tự do của phản ứng giữa phân tử chất kháng oxy hóa với các gốc tự do hoạt động. Dựa vào cơ chế của phản ứng oxy hóa người ta đã đưa ra nhiều phương pháp đo khác nhau.

Đối với phản ứng theo cơ chế chuyển proton (Hydrogen Atom Tranfer), người ta thường sử dụng các phương pháp sau:

- ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity): phương pháp dựa vào khả năng hấp thụ các gốc tự do của oxygen.

- TRAP (TotalTrapping Antioxidant Parameter): phương pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa tổng cộng.

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 25

- LDL oxidation (Low Density Lipoprotein oxidation): phương pháp dựa vào sự oxy hóa của lipoprotein tỷ trọng thấp.

- TOSC (Total Oxidant Scavenging Capacity): phương pháp đo khả năng làm sạch sự oxy hóa tổng cộng.

Các phương pháp đối với cơ chế chuyển electron (Single Electron Tranfer):

- FRAC (Ferric Reducing Antioxidant Power): phương pháp khử sắt.

- TEAC (Trolox equivalent antioxidant activity): phương pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa đương lượng Trolox.

- DPPH (2,2-diphenyl1picrylhydrazyl): phương pháp đo khả năng bắt gốc tự do DPPH. Gốc tự do DPPH (1,1diphenyl2picrylhydrazyl) là gốc tự do bền do có hiệu ứng liên hợp trong toàn phân tử, cho màu tím trong ethanol và có độ hấp thu cực đại tại 517 nm.

Hình 1 Đồ thị biểu diễn màu của phương pháp DPPH

Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng và áp dụng cho từng loại chất oxy hóa.

Thông thường, người ta thường dựa vào các điều kiện như: khả năng phòng thí nghiệm, tính khả thi trong các hệ thống sinh học, mức độ đơn giản của phương pháp, cơ chế phản ứng, loại chất kháng oxy hóa, thời gian, … để chọn phương pháp nghiên cứu hoạt tính phù hợp.

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 26

V.5.1 Tìm hiều về DPPH 1, 16, 35, 44

DPPH: 1,1diphenyl2picrylhydrazyl (,diphenylpicrylhydrazyl) là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dime hóa như một số gốc tự do khác.

Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử H, nó sẽ chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl). Phản ứng được thực hiện như sau:

1,1diphenyl2picrylhydrazyl 1,1diphenyl2picrylhydrazine V.5.2 Lịch sử của phương pháp DPPH 1, 16, 35, 44

Phương pháp DPPH được Marsden Blois sử dụng đầu tiên vào năm 1958 ở Đại học Stanford. Bài báo nghiên cứu về DPPH được đăng trên tạp chí Nature chỉ vỏn vẹn có một trang (Blois. M.S. 1958. Antioxidant determination by the use of stable free radical, Nature, 181, 11991200) nhưng nú đó trỡnh bày một cỏch rừ ràng toàn bộ phương phỏp. ở thí nghiệm đầu tiên này, Blois đã thử hoạt tính kháng oxy hóa của amino cysteine bằng cách dùng DPPH chuẩn độ nó rồi đo độ hấp thu theo thời gian ở bước sóng =517 nm.

Sau đó nhiều nhà khoa học: BrandWilliams, Lebeau, Yepez, đặc biệt là Philip Molyneux…đã nghiên cứu sâu hơn về phương pháp này và rút ra được nhiều kết luận quan trọng.

V.5.3 Dung môi và pH của phản ứng 1, 16, 35, 44

Trong nghiên cứu ban đầu của Blois, ông dùng hệ dung dịch đệm acetate ở pH 5,06,5 trong dung môi nước. Tuy nhiên, qua kết quả của nhiều nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học nhận thấy rằng methanol và ethanol là 2 dung môi tốt nhất và không cần điều chỉnh pH trong dung môi methanol hay ethanol đang dùng.

NO2

NO2

N N

O2N + RH

NO2

NO2 HN N

O2N + R

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 27

V.5.4 Đo độ hấp thu 1, 16, 35, 44

Giá trị các bước sóng hấp thu cực đại khi tiến hành đo mẫu theo mỗi tác giả có sự khác nhau, nhưng trên thực tế kiểm nghiệm thì đỉnh hấp thu cực đại nằm ở bước sóng khoảng 515520 nm. Ví dụ như: BrandWilliams, 1995 đo độ hấp thu ở 515 nm;

Schwarz, 2001 đo ở 516 nm; Blois, 1958 đo ở 517 nm; Leitao, 2002 đo ở 518 nm; Kim, 2002 đo ở 520 nm,…

V.5.5 Thời gian phản ứng 1, 16, 35, 44

Thời gian phản ứng phụ thuộc vào hàm lượng tác chất đem phản ứng. Theo kết quả khảo sát trên nhiều tác chất khác nhau, thời gian tốt nhất là 30 phút sau khi phản ứng đã thực hiện xong.

V.5.6 Kết quả tính toán 1, 16, 35, 44

Để khảo sát khả năng kháng oxy hóa, người ta thường dùng thuật ngữ: Phần trăm ức chế Q. Q được định nghĩa như sau:

Q=((A0Ac)/A0)x100

Trong đó: A0 là độ hấp thu DPPH khi không có mẫu (mẫu trắng).

Ac là độ hấp thu của dung dịch phản ứng.

Ngoài ra kết quả thử kháng oxy hoá theo phương pháp DPPH được quy về giá trị IC50 50% hoặc EC5050%. Thông số này được định nghĩa là nồng độ tác chất phản ứng làm giảm 50% hàm lượng DPPH. Vậy ứng với một giá trị nồng độ DPPH xác định, giá trị IC50 hoặc EC50 càng nhỏ thì khả năng kháng oxy hoá càng cao.

TRẦN THỊ HƯỞNG  091021 Trang 28