1.6.3.1. Tủa bằng muối
Đây là cách phổ biến để tủa Protein. Khả năng hòa tan của Protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của Protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối…
Ở nồng độ muối thấp, tính tan của Protein tăng nhẹ (Salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của Protein giảm mạnh (Salting out).
Đầu tiên, giả thuyết Salting in ở nồng độ muối thấp được giải thích bởi Debye – Huckel như sau: trong dung dịch, Protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái dấu. Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân tử Protein không mang điện tích, do đó làm tăng tính tan của Protein trong dung môi. Giả thuyết của Debye – Huckel cho rằng: tính tan của Protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch.
Thuật ngữ Salting out trong môi trường có nồng độ muối cao được giải thích bởi Kirkwood. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa, giảm tính hòa tan của Protein dẫn đến sự tủa.
Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn:
Trong đó:
+ S: độ hòa tan của Protein.
+ B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của Protein, pH và nhiệt độ).
+ K: hằng số Salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch). + I: cường độ ion của muối.
Hiệu quả tủa Protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: ciTrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > niTrate > thiocyanate.
1.6.3.2. Tủa Protein bằng các dung môi hữu cơ
Khi thêm dung môi hữu cơ vào trong dung dịch sẽ làm cho hằng số điện môi của dung dịch giảm xuống. Mối quan hệ giữa độ hòa tan và hằng số điện môi được thể hiện qua công thức sau:
w w 1 1 ln S A . S RT D D = − Trong đó:
+ S: độ hòa tan của Protein trong dung môi hữu cơ. + Sw: độ hòa tan của Protein trong nước.
+ D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ. + Dw: hằng số điện môi của nước.
+ R: hằng số khí. + T: nhiệt độ tuyệt đối. + A: hằng số khí.
Công thức trên cho thấy: Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của Protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kị nước của phân tử Protein. Kết quả là chúng làm biến tính Protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tiến hành kết tủa nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp.
Chỉ có một số dung môi như: 2 – Methyl – 2,4 – Pentanediol (MPD), Dimethyl Sulfoxide (DMSO) và Ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao.
1.6.3.3. Tủa Protein bằng phương pháp điểm đẳng điện
Đa số các Protein có điểm đẳng điện nằm trong miền Acid hoặc kiềm yếu do hằng số phân ly của các nhóm –COOH lớn hơn hằng số phân ly của các nhóm –NH2 và các phân tử Protein thường chứa các nhóm Acide và Base với số lượng khác nhau. Điều này quyết định pH của nó nằm trong miền Acide hay Base yếu. Ở điểm đẳng điện, tổng điện tích của phân tử Protein bằng không và dung dịch Protein kém bền vững nhất. Protein trong dịch thải thường tồn tại ở trạng thái hòa tan. Lợi dụng ưu điểm này để đông tụ Protein, tức là để phá vỡ trạng thái hòa tan của Protein có trong dịch cần đưa pH dịch thải về điểm đẳng điện của đa số Protein có trong dịch thải. Dùng dung dịch Acide để điều chỉnh pH về điểm đông tụ của đa số Protein.
Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ tủa của Protein cũng thay đổi. Ở pH thấp, Protein tích điện dương vì nhóm amine bị proton hóa (thu nhận proton). Ở giá trị pH cao, Protein tích điện âm vì các nhóm carboxyl trong phân tử Protein bị mất đi proton (mất H+). Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện) Protein không tích điện, tức tương tác giữa Protein – Protein là cực đại và sự hydrat hóa, trương nở là cực tiểu.
Bảng 1.7: Giá trị pHi của một số loại Protein [2]
Loại Protein pI Loại Protein pI
Albumin trứng 4.6 Hemoglobin 6.8
Caseine 4.7 Ribonuclease 7.8
Serumalbumine 4.9 Tripsine 10.5
Gelatine 4.9 Xitocrome 10.6
Globuline 5.2 Prolamine 12.0
1.6.3.4. Tủa Protein bằng các Non – ionic Polymer
Phương pháp này được thực hiện bằng cách cho thêm Non – ionic Polymer vào trong dung dịch Protein. Khi thêm vào, số lượng các phân tử nước có thể tương tác được với Protein giảm xuống. Các Non – ionic Polymer thường sử dụng dexTrans và polyethylen glycols.
µi = µi0 + RT (ln mi + fii mi + fij + mj) Trong đó:
+ µi0: điện thế hóa học chuẩn của phần tử i. + µi: điện thế hóa học của phần tử i.
+ R: hằng số khí. + T: nhiệt độ tuyệt đối.
+ mi, mj: nồng độ molar của phần tử i và j. + fii: hệ số tương tác của phần tử i.
+ fij: hệ số tương tác giữa phần tử i và j.
Khi Protein tồn tại ở nồng độ cao, hay pH môi trường vượt ra ngoài điểm đẳng điện mới xảy ra quá trình tương tác giữa các cấu tử trong Protein.
Muốn thêm loại Non – ionic Polymer nào vào trong dung dịch Protein tùy thuộc vào trọng lượng phân tử của Protein đó. Cũng tương tự như tủa Protein bằng phương pháp điểm đẳng điện. Tại một giá trị pH nào đó (sau khi thêm Non – ionic Polymer) thì khả năng hòa tan của Protein cũng giảm xuống. Các ion Non – ionic Polymer thường sử dụng là các dung môi hữu cơ như Ethanol hay Acetone. Các dung môi khác ít sử dụng vì khó thao tác và có thể gây biến tính Protein. Với phương pháp này cần chú ý những điểm sau:
+ Nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả tủa và giảm sự biến tính Protein.
+ Nồng độ ion thích hợp là 0,05 – 0,2 M. Nồng độ cao quá sẽ gây dư thừa dung môi và khó khăn cho việc tách chiết.
+ Trọng lượng phân tử của Protein hòa tan càng cao thì lượng dung môi cần cho quá trình tủa càng ít.
Theo Scopes (1982), khi tủa bằng Acetone thì tuân theo công thức sau: [(v/v)%] = 1,8 – 0,12 ln [MW]
Trong đó:
+ (v/v)%: thể tích dung môi cần cho quá trình tủa (tính theo %). + MW: khối lượng phân tử của chất tan.
- Nếu có mặt đồng thời hai loại Protein trong dung dịch thì tính tan của một Protein sẽ giảm vì sự có mặt của Protein kia.
- Kết tủa thu được thường khó tan trở lại vì đã bị biến tính. Tuy nhiên, thuận lợi của phương pháp tủa bằng Non – inoic Polymer là sản phẩm của Protein thu được bền và có thể sử dụng được ở nhiệt độ phòng.
1.6.3.5. Tủa bằng ion kim loại
Trong phương pháp tủa này, ion kim loại sẽ gắn với một phần của phân tử Protein. Thuận lợi của phương pháp này là có thể tủa được Protein trong một dung dịch rất loãng. Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm. Các ion như Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ và Cd2+ sẽ gắn chặt vào các Acid carboxylic và các hợp chất có chứa nitrogen. Các ion như Ca2+, Ba2+, Mg2+ và Pb2+ sẽ gắn với nhóm chức Acid carboxylic. Các ion như Ag2+, Hg2+, và Pb2+ sẽ gắn chặt với các nhóm có chứa lưu huỳnh.
Tuy nhiên, khó khăn của phương pháp kết tủa Protein bằng các ion kim loại là phải tìm cách tách các kim loại ra khỏi chế phẩm Protein thu được, đặc biệt là các kim loại nặng có nhiều độc tính như Ag+, Hg2+ và Pb2+…
1.6.3.6. Tủa Protein bằng cách nâng nhiệt
Nâng nhiệt là phương pháp đơn giản nhất để thu hồi Protein hòa tan trong dung dịch. Đặc điểm của phương pháp này là đơn giản và dễ thực hiện. Tuy nhiên nếu xử lý với khối lượng dịch thải máu cá lớn thì phương pháp này rất tốn kém về kinh tế.
Đun nóng nhằm mục đích phá vỡ vỏ điện tích và khả năng hydrat hóa của Protein. Khi nhiệt độ tăng làm chuyển động nội tại của các phân tử Protein tăng sẽ phá vỡ các liên kết hydrogen tự nhiên của Protein làm giảm khả năng hydrat hóa, làm tăng liên kết giữa các Protein với nhau tạo thành từng cụm tụ lại lớn dần, trọng lượng từng cụm Protein keo tụ lớn dần và lắng xuống.
Không những thế quá trình đun nóng còn có tác dụng làm bay hơi các chất mang mùi tanh của dịch thải từ đó sẽ làm cho sản phẩm có mùi tốt hơn. Đun nóng còn có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật có hại, ức chế và làm nhưng hoạt động của các enzym. Chính điều này đã góp phần làm tăng thời gian bảo quản sản phẩm Protein trước khi sử dụng.
1.7. TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN [2, 16, 17] 1.7.1. Cấu trúc và tính chất của Chitosan 1.7.1. Cấu trúc và tính chất của Chitosan 1.7.1.1. Cấu trúc của Chitosan
Chitosan là dẫn xuất đề axetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C(2). Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết b - (1 - 4) - glicozit. Chitosan có tên hóa học là: b – (1 – 4) – 2 – Amino – 2 – Deoxy – D – Glucopyranose. Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị b – D – glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết b – (1– 4 ) Glucozit.
+ Công thức phân tử: ( C6H11O4N)n + Phân tử lượng: M = (161.07)n + Công thức cấu tạo:
Hình 1.5: Công thức cấu tạo của Chitosan [2, 16] 1.7.1.2. Tính chất của Chitosan
Đặc tính cơ bản của Chitosan
Chitosan có nguồn gốc thiên nhiên, không độc, dùng an toàn cho người trong thức ăn, thực phẩm, dược phẩm, có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học, có nhiều tác dụng sinh học đa dạng: có khả năng hút nước, giữ ẩm, kháng nấm, kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích tăng sinh tế bào ở người, động vật, thực vật, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng.
Tính chất vật lý
Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng vảy trong suốt, dạng bột có màu vàng nhạt hay màu trắng ngà, không mùi, không vị.
Chitosan có nhiệt độ nóng chảy 309oC – 310oC, trọng lượng phân tử trung bình từ 10.000 – 500.000 dalton tùy loại. Loại Chitosan có trọng lượng phân tử trung bình (M) từ 200.000 đến 400.000 hay được dùng nhiều nhất trong y tế và thực phẩm.
Tính chất hóa học
Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, dung dịch kiềm và Acid đậm đặc nhưng hòa tan trong môi trường Acid loãng (pH = 6 – 6,5) tạo dung dịch keo trong.
Khi hòa tan trong môi trường Acid acetic loãng tạo thành dung dịch keo dương, nhớt và trong suốt, do đó keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như Hg+, Pb++…
Chitosan kết hợp với Aldehyt trong điều kiện thích hợp hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào và enzyme. Chitosan phản ứng với Acid đậm đặc, tạo thành muối khó tan, tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng màu tím, phản ứng này dùng để phân tích định tính Chitosan.
Tính chất sinh học
Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u.
Ngoài ra, Chitosan còn có tác dụng làm giảm Cholesterol và Lipid máu, làm to vi động mạch và hạ huyết áp, điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết.
Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các Peptide – Insulin, kích thích việc tiết ra Insulin ở tuyến tụy nên Chitosan được dùng để điều trị bệnh tiểu đường.
1.7.2. Ứng dụng của Chitosan [1, 16, 17]
Ứng dụng trong y học
Chitosan là vật liệu hòa hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà còn ứng dụng an toàn trong ghép mô.
Chitosan còn có khả năng chống viêm cấp trên mô lành. Băng cứu thương kiểu mới, kỹ thuật cao, có thành phần cấu tạo bởi chất Chitosan. So với các loại băng thường, tốc độ cầm máu, tính sát khuẩn và thời gian lành mô khi sử dụng loại băng này có hiệu quả hơn gấp nhiều lần.
Từ Chitosan, người ta đã bào chế ra nhiều loại thuốc điều trị các bệnh như: nhiễm xạ, chữa bỏng, giảm đau, thuốc hạ cholesterol, chữa bệnh dạ dày, đông tụ máu… Viện Vacxin Nha Trang đã nghiên cứu và sản xuất ra 2 sản phẩm Chitosan chữa béo phì và Glusivac điều trị thoái hóa khớp. Hai loại thuốc này đã được Bộ Y tế cấp phép lưu hành toàn quốc vào đầu tháng 6/2005.
Chitosan được tinh chế dùng làm chỉ khâu, da nhân tạo, làm liền sẹo các vết thương, thấu kính tiếp xúc, thuốc chữa bệnh viêm loét dạ dày-tá tràng, bào chế dược phẩm, ... Ngày nay, vẫn còn nhiều hướng được nghiên cứu về tác động kích thích miễn dịch, chống ung thư, làm giảm Cholesterol và không tác dụng phụ, nó cũng có tác dụng làm mau lành sau khi nhổ răng và được dùng để bọc các viên thuốc.
Ứng dụng trong xử lý nước thải
Do Chitosan là Polymer mang điện tích dương nên Chitosan được dùng để xử lý nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy hoá chất và thực phẩm.
Đó là nhờ khả năng kết đông và khả năng tạo phức với các ion kim loại nặng như chì, thuỷ ngân,… của keo Chitosan, làm lắng các vật thể lơ lửng trong nước thải.
Hiện nay, người ta đã dùng Chitosan để hấp phụ các ion kim loại nặng gây ô nhiễm môi trường sinh thái như Cu2+, Hg2+, Crn+, Pb2+, Ni2+, Cd2+. . . trong đó Crom gây nguy hiểm cho hệ sinh thái nhất. Crom có thể tồn tại ở nhiều dạng với nhiều số oxi hoá khác nhau, trong số đó, chỉ có những hợp chất hóa trị (III) với hoá trị (V) là thân thiện, quan trọng với môi trường. Cr (VI) có thê gây hại vì nó phân tán ở dạng
CrO42- hay HCrO4- có thể oxi hoá những phân tử sinh học. Mặt khác, do có khả năng hoà tan cao, Cr (VI) có thể gây hại cho sự sống của sinh vật hơn Cr(III). Kĩ thuật cổ điển để loại bỏ ion kim loại nặng từ nước thải bao gồm các công đoạn như kết tủa, tách qua màng, thẩm thấu ngược, bay hơi và xử lí điện hoá. Tuy nhiên, với những cách làm như vậy thì không hiệu quả đối với những nguồn nước thải có hàm lượng ion kim loại độc thấp. Hiện nay, người ta tìm cách hạ giá thành của qui trình bằng cách tìm những vật liệu có khả năng hấp thụ các ion kim loại độc này. Và Chitosan là chất đã làm được điều đó.
Sử dụng làm dung môi lọc
Bộ môn Công nghệ Chế Biến – Trường Đại học Thủy Sản và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng Chitosan để tinh chế và nâng cao chất lượng Agar – Agar, giúp giải quyết khó khăn về công nghệ, đặc biệt là quá trình lọc thực hiện đễ dàng, giải quyết tồn tại chất lượng của Agar hiện nay.
Tạo kết cấu cho thực phẩm và tẩy màu
Ngoài ra Chitosan còn tạo kết cấu cho thực phẩm liên kết, ổn định mùi vị, loại bỏ chất chát tamin trong quả nhờ chất MCC (Mycre Cregslalline Chitine). Chitosan có tính tẩy màu mà không hấp thụ mùi và các thành phần khác nên người ta đã ứng dụng nó lên việc khử màu thức uống ở nồng độ 1 gam Chitosan bột cho 100ml nước uống.
Ứng dụng trong nông nghiệp
Bọc nang hạt giống: Năm 1987 Betech dã được cấp bằng sáng chế nhờ nghiên cứu ứng dụng của Chitosan trong việc bọc nang hạt giống để ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất. Trong những vùng đất mà cây trồng thường bị nấm tấn công vào hệ rễ, nếu hạt giống được bọc nang bằng Chitosan sẽ nâng cao hiệu suất thu hoạch lên 80 % so với không dùng Chitosan.
Chitosan vi lượng: Chitosan vi lượng có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu và kích thích tăng khả năng nẩy mầm của hạt.
Từ nghiên cứu ảnh hưởng của Chitosan vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh lý. Sinh hoá của mạ lúa CR–205 trong điều kiện nhiệt độ thấp của Lê Thu Hiền và
Lê Thị Lan Oanh cho thấy Chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục tổng số