4. Nội dung của đề tài:
2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu vỏ tôm thẻ được thu tại phân xưởng chế biến, Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Yêu cầu nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Nguyên liệu được rửa sạch và xay nhuyễn (trong đó có 100% là vỏ tôm, tất cả các mẫu thí nghiệm đều được xay bởi cùng một thiết bị và kích thước mẫu sau khi xay là 0,5 ÷ 0,8 cm) và tiến hành làm thí nghiệm ngay. Trong trường hợp chưa làm ngay thì rửa sạch, cân cho vào túi polyme (mỗi túi 1 kg), bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ - 20oC.
2.2.2. Bố trí thí nghiệm
2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Thuyết minh quy trình:
1. Nguyên liệu tôm còn lại sau khi chuyển từ công ty đảm bảo điều kiện nhiệt độ 0 – 5 oC, nhặt tạp chất và đầu hay thân tôm lẫn vào. Rửa sạch vỏ tôm rồi để ráo khoảng 10 phút. Vỏ tôm chia thành từng phần đem cấp đông (nhiệt độ -20oC).
Bã Rửa Khử protein bằng Pepsin kết hợp khử khoáng bằng HCl Alcalase/nguyên liệu : 0,2% Bổ sung H2O/NL là 1:1, 550C, 8 h Nồng độ HCl bổ sung ? Thời điểm bổ sung En ? Tỷ lệ E/S ? Thời gian ? Nhiệt độ ? Chitin Rã đông, xay Rửa sạch, để ráo cấp đông Vỏ tôm nguyên liệu
Khử protein bằng Alcalase
Bã Dịch
Dịch
Mẫu thí nghiệm được rã đông và xay nhỏ, kích thước khoảng 0,5-0,8 cm, mỗi mẫu 100g.
2. Các mẫu được khử protein bằng enzyme Alcalase với các thông số cố định tỷ lệ enzyme Alcalase/nguyên liệu 0.2%; tỷ lệ nước bổ sung 1:1, thủy phân ở nhiệt độ 55oC trong 8 giờ.
3. Sau khử protein bằng Alcalase mẫu được tách riêng dịch và bã. Xác định lượng dịch thu được. Dịch thủy phân bất hoạt nhiệt 100oC trong 15 phút. Kiểm tra hàm lượng protein hòa tan.
4. Bã được bổ sung HCl ở các nồng độ và thể tích khác nhau như bố trí trong thí nghiệm và theo dõi sự biến động pH và mức độ khử khoáng theo thời gian. Khi pH ổn định, bổ sung enzyme Pepsin theo các nồng độ, thời gian và nhiệt độ khác nhau.
5. Sau thủy phân bằng Pepsin mẫu được tách riêng phần dịch và bã. Bã rửa sạch, phơi khô và kiểm tra các chỉ tiêu hàm ẩm, hàm lượng khoáng, hàm lượng protein còn lại và màu sắc bã. Dịch sau thủy phân đưa lên PH = 13 bằng NaOH 10%, lọc và kiểm tra hàm lượng protein hòa tan.
6. Tùy thuộc vào hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại trên bã ta có công đoạn khử khoáng và khử protein tiếp theo.
2.2.2.2. Xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ tôm.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ tôm thẻ XĐHL khoáng XĐHL protein XĐHL ẩm Tính kết quả Vỏ tôm
2.2.2.3. Xác định thành phần hóa học của dịch, bã ép sau khử protein bằng Alcalase: Alcalase:
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần của bã sau thủy phân bằng Alcalase
Tiến hành:
+ Xác định hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân: Dịch thủy phân được bất hoạt ở 100oC trong 10 phút, lọc bằng giấy lọc, và pha loãng với tỷ lệ 1/5 bằng nước cất sau đó xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp biuret. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, loại số liệu bất thường và tính kết quả.
+ Xác định hàm lượng protein trong bã tôm sau xử lý Alcalase: Phơi khô bã, 1 phần xác định hàm lượng ẩm và khoáng. Một phần chiết: cân 1g mẫu bào bình chiết, thêm 30ml NaOH 3% tiến hành chiết ở 80 oC trong 8h. Định mức dịch V1 ml kiểm tra
Alcalase 0,2 % Bổ sung H2O:Nguyên liệu là 1:1 o Vỏ tôm thẻ Rửa sạch, cấp đông Xay nhỏ Khử protein bằng Alcalase Bã Dịch
Kiểm tra hàm lượng protein hòa tan
Kiểm tra các chỉ tiêu:
- Độ ẩm
- Protein tổng số - Tro tổng số
hàm lượng protein còn lại bằng phương pháp microbiuret và tính kết quả. Thí nghiệm lặp 3 lần loại giá trị bất thường. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2.4. Xác định mức độ khử khoáng khi sử dụng HCl ở các nồng độ khác nhau và chọn thời điểm bổ sung Pepsin nhau và chọn thời điểm bổ sung Pepsin
Vỏ tôm lấy ở tủ đông xay chia làm nhiều mẫu, mỗi mẫu 100g/mẫu
bổ sung H2O với tỉ lệ 1:1 và Alcalase 0,2 % thủy phân ở 55oC trong 8h sau khi thủy phân xong chia thành 2 phần: phần dịch 1 và phần bã. Phần bã đem đi khử khoáng: Căn cứ vào số liệu phân tích ở mục 2.2.2.3 cho ta biết được hàm lượng khoáng có trong bã sau khi khử protein bằng enzyme Alcalase, từ đó sẽ tính toán được số mol HCl cần dùng để khử hết lượng khoáng còn lại trên bã sau quá trình khử protein với Alcalase theo phương trình phản ứng sau:
CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4
n HCl = 2n CaCO3
Từ số mol HCl cần dùng đó, tiến hành pha dung dịch HCl ở các nồng độ khác nhau: 1%, 2%, 4%. Tiến hành theo dõi pH 1 lần/giờ trong vòng 9 giờ và mức độ khử khoáng của các dung dịch HCl có nồng độ khác nhau đó theo thời gian: 1h, 2h, 3h, 4h, 6h, 9h, 12h. Mẫu thí nghiệm được đem đi rửa, phơi khô và xác định hàm lượng tro tổng số.
Chọn nồng độ HCl và thời điểm bổ sung Pepsin phù hợp.
2.2.2.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ, thời gian và nhiệt độ đến khả năng khử protein của Pepsin khử protein của Pepsin
Qua phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến công đoạn thủy phân sử dụng enzyme Pepsin, dựa trên kết quả thăm dò ta có thể thấy có các yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân là:
- Nồng độ enzyme.
- Nhiệt độ thủy phân.
- Thời điểm bổ sung Enzyme - Thời gian thủy phân.
Trong đó ta cố định các thông số (đã được xác định ở các thí nghiệm trên):
- pH môi trường ( tỷ lệ HCl và nồng độ HCl)
- Thời điểm bổ sung enzyme
Các thông số nồng độ enzyme, thời gian, nhiệt độ được nghiên cứu tối ưu hóa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm phân tích hồi quy 3 yếu tố sau đó tối ưu hóa quá trình bằng phương pháp đường dốc nhất để tìm giá trị tối ưu.
Chọn các thông số cần tối ưu chạy trong khoảng giá trị là:
- Nồng độ enzyme trong khoảng: [0.005 ÷ 0.05%] - Thời gian thủy phân trong khoảng: [2h ÷ 12h] - Nhiệt độ thủy phân trong khoảng: [27oC ÷ 43oC]
Hàm mục tiêu là: Hàm lượng protein còn lại trên chitin (%) → Min.
Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử protein bằng enzyme Pepsin:
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm của công đoạn khử protein bằng enzyme Pepsin
N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X0 X1 X2 X3 Y(%)
1 0.005 27 2 1 -1 -1 -1 2 0.05 27 2 1 1 -1 -1 3 0.005 43 2 1 -1 1 -1 4 0.05 43 2 1 1 1 -1 5 0.005 27 12 1 -1 -1 1 6 0.05 27 12 1 1 -1 1 7 0.005 43 12 1 -1 1 1 8 0.05 43 12 1 1 1 1
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng enzyme Pepsin STT U1 U2 U3 Y(%) 9 0.0275 35 7 10 0.0275 35 7 11 0.0275 35 7 U1: nồng độ enzyme (%), U2: nhiệt độ thủy phân (oC) U3: thời gian thủy phân (giờ)
Phương trình hồi quy:Y= b0 + b1x1+ b2x2 + b3x3
2.2.3. Thiết lập quy trình sản xuất chitin sử dụng Alcalase kết hợp với Pepsin để khử protein. để khử protein.
Sau khi tìm được nồng độ và tỉ lệ HCl phù hợp, tìm ra được thời điểm bổ sung enzyme Pepsin, và các thông số tối ưu cho công đoạn khử protein bằng Pepsin như thời gian, nhiệt độ, tỉ lệ enzyme/nguyên liệu ta tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu hàm lượng khoáng và hàm lượng protein còn lại trên bã. Nếu hàm lượng khoáng ≥ 1% và hàm lượng protein ≥ 1% thì ta sẽ đề xuất công đoạn khử protein và khử khoáng tiếp theo.
2.2.4. Phương pháp xác định các chỉ tiêu
* Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy 105 oC. hàm lượng chất khô = 100% - hàm lượng ẩm (AOAC 1990)
* Hàm lượng khoáng tổng số bằng phương pháp nung 550oC. (AOAC 1990) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 3705- 1990. Hàm lượng protein = hàm lượng nitơ tổng số * 6.25.
* Hàm lượng protein hòa tan và protein còn lại trên bã bằng phương pháp biuret và microbiuret.
* Màu sắc chitin được đánh giá bằng cảm quan.
* Chỉ tiêu chất lượng chitin dựa vào chỉ tiêu chitin sử dụng trong y học ( Việt Nam dược điển).
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu.
Số liệu được xử lý để tính toán trên phần mềm Excel. Tất cả các số liệu được lấy từ kết quả trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm song song.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ:
Để đánh giá được quá trình khử khoáng, protein thì cần xác định thành phần hóa học của vỏ tôm thẻ chân trắng dùng làm đối tượng nghiên cứu. Kết quả phân tích thành phần hóa học của phế liệu vỏ tôm thẻ chân trắng được trình bày tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của phế liệu vỏ tôm thẻ chân trắng (%)
Chỉ tiêu Protein (*) Hàm ẩm Tro (*)
Thành phần
hóa học (%) 29.15 ± 0.684 73.52 ± 0.354 28.43 ± 0.75 (*)Tính theo vật chất khô
Kết quả phân tích cho thấy vỏ tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) có hàm lượng protein (29.15 %) và hàm lượng khoáng (28.43%) tính theo vật chất khô là khá cao. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Xoa (đồ án tốt nghiệp 2010). So với hàm lượng protein và hàm lượng khoáng có trong đầu tôm thẻ của Nguyễn Thị Ngọc Hoài (đồ án tốt nghiệp 2009) tương ứng là 49% và 25.2% thì hàm lượng protein trong vỏ tôm thẻ là thấp hơn và hàm lượng khoáng cao hơn. Do đó việc khử protein trên vỏ tôm sẽ dễ dàng hơn so với đầu tôm, đồng thời việc khử khoáng lại khó khăn hơn. Từ bảng 3.1 cho thấy cần sử dụng phương pháp sinh học để thủy phân protein để tận dụng lượng protein có chất lượng vào việc chế biến thức ăn gia súc,… đồng thời nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin vừa có hiệu quả kinh tế, vừa mang ý nghĩa môi trường.
3.2. Thành phần hóa học của dịch, bã ép sau khử protein bằng Alcalase:
Vỏ tôm sau khi cấp đông, xay nhỏ, thủy phân bằng enzyme Alcalase 0,2%, bổ sung nước tỉ lệ 1:1, thủy phân ở 55oC trong 8h. Sau khi thủy phân xong đem phần bã đi phân tích các chỉ tiêu ta được kết quả ở bảng sau:
Chỉ tiêu Protein (*) (%) Hàm ẩm ( %) Tro tổng số (*) (%) Protein hòa tan (%)(a) trên bã 9.78 ± 0.27 82 ± 0.61 23.34 ± 0.36 trên dịch 14.81 ± 0.17 (*)Tính theo vật chất khô
(a) So với tổng protein ban đầu
Qua kết quả trên cho ta thấy nếu sử dụng enzyme Alcalase 0,2%, thủy phân vỏ tôm ở chế độ 55oC trong 8h sẽ khử được 66.45 % lượng protein có trong vỏ tôm thẻ (protein còn lại trên bã chỉ còn 9.78), kết quả này cũng phù hợp với kết quả của Chabeaud, Guerard, Laroque và Dufosse 2007, Nguyễn Thị Ngọc Hoài (đồ án tốt nghiệp 2009). Hàm lượng khoáng qua công đoạn này giảm nhưng không đáng kể, tuy nhiên sẽ làm cho cấu trúc vỏ tôm thay đổi, vỏ tôm trở nên mềm hơn do đó sẽ dễ dàng cho công đoạn khử khoáng tiếp theo. Ngoài ra, ta thấy rằng protein hòa tan có trong dịch cũng khá cao, như vậy nếu dùng enzyme Alcalase để thủy phân có thể sẽ mang lại ý nghĩa cho hướng thu hồi protein và astaxanthin có giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học cao.
Từ kết quả phân tích hàm lượng khoáng này ta sẽ tính được số mol HCl cần dùng cho công đoạn khử kháng tiếp theo là: (Tính cho 100g mẫu nguyên liệu)
n HCl = 2n CaCO3 = 2*(23.34*18/100)/100 = 0.0842 (mol) C D n M V * * * 100 = V(HCl 4%) = 100*36.5*0.0842/(1.14*4) = 67 (ml) V (HCl 2%) = 134 ml V (HCl 1%) = 268 ml
3.3. Xác định thời điểm bổ sung Pepsin và nồng độ HCl. 3.3.1. Biến đổi pH trong quá trình khử khoáng 3.3.1. Biến đổi pH trong quá trình khử khoáng
Enzym Pepsin hiện đang dùng với mã số P7000 có pH trong khoảng từ 1,5 đến 4, trong đó tối thích từ 2-2,5. Ở pH nhỏ hơn 1,5 và lớn hơn 4,5 khả năng hoạt động của enzym giảm đáng kể, khi ở pH trên 8 thì bị biến tính không thuận nghịch
và bị bất hoạt hoàn toàn. Vì thế việc theo dõi sự biến động của pH và xác định thời điểm bổ sung Pepsin rất quan trọng.
Tùy thuộc vào mức độ khử khoáng, cấu trúc của vỏ tôm sẽ có độ “rỗng , xốp” nhất định, tạo điều kiện cho Pepsin xâm nhập và thủy phân protein ở các lớp sâu bên trong, làm giảm hàm còn lại trên chitin.
Từ số mol HCl cần dùng tính được ở mục 3.2, tiến hành pha dung dịch HCl ở các nồng độ khác nhau: 1%, 2%, 4%. Tiến hành theo dõi pH 1 lần/giờ trong vòng 9 giờ.
Khảo sát sự biến đổi pH theo thời gian và nồng độ HCl 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Thời gian ( h ) p H 1% 2% 4%
Hình 3.1. Sự biến đổi pH theo thời gian ở các nồng độ khác nhau
Nhìn vào đồ thị ta thấy trong 3 giờ đầu ở tất cả các mẫu 1%, 2%, và 4% pH tăng nhanh, và sau 4 giờ thời gian khử khoáng càng tăng thì pH càng tăng, tuy nhiên tăng không đáng kể. Trong cùng một thời gian thì nồng độ 4% cho pH thấp nhất còn 1 % thì cho pH cao nhất.
Giải thích: Trong vỏ các loài giáp xác chitin liên kết với protein và khoáng theo từng lớp tạo nên độ chắc cho lớp vỏ. Quá trình loại bỏ khoáng chủ yếu là muối canxi cacbonat và một ít canxi photphat. Khi cho HCl vào sẽ diễn ra phản ứng:
CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Do đó pH sẽ tăng lên dần theo thời gian, trong 3h đầu phản ứng xảy ra mạnh do đó pH tăng nhanh
3.3.2. Mức độ khử khoáng theo thời gian ở các nồng độ khác nhau
Trong quá trình khử khoáng mức độ của quá trình khử khoáng phụ thuộc rất nhiều yếu tố như nồng độ acid, tỉ lệ acid/nguyên liệu, thời gian xử lý.... Do đó việc nghiên cứu chọn ra các thông số trên phù hợp để vừa đạt được hiệu suất khử khoáng và hiệu quả kinh tế cao nhất là cần thiết.
Mức độ khử khoáng theo thời gian và nồng độ HCl 0 5 10 15 20 25 30 Thời gian ( h ) h à m l ư ợ n g k h o á n g % 1% 2% 4% 1% 23.34 5.035 3.752 2.866 2.114 1.828 1.091 1.035 2% 23.34 4.153 2.382 1.887 1.366 1.136 0.963 0.959 4% 23.34 4.617 3.485 2.072 1.815 1.431 0.997 0.957 0 1 2 3 4 6 9 12
Từ các thí nghiệm và nhìn vào đồ thị, nhận thấy trong 4 giờ đầu tốc độ khử khoáng diễn ra nhanh chóng, và khi tăng thời gian khử khoáng thì hàm lượng khoáng giảm dần. Khi tiếp tục tăng thời gian khử khoáng thì hàm lượng khoáng giảm không đáng kể, mặt khác thời gian khử khoáng > 9h thì hàm lượng khoáng còn lại cũng đã < 1%.
Giữa các nồng độ 1%, 2% và 4% mức độ khử khoáng có sự chênh lệch không nhiều, nhận thấy ở 2% thì khả năng khử khoáng là tốt nhất, điều này có thể là do ở nồng độ 4% lượng dung dịch không đủ ngập mẫu nên HCl không tiếp xúc triệt để, còn mẫu 1% thì nồng độ không đủ mạnh để tốc độ diễn ra nhanh được.
Do vậy nếu chitin-chitosan yêu cầu hàm lượng khoáng thấp và độ nhớt cao thì ta có thể chọn các thông số tối ưu cho quá trình khử khoáng để giảm được nồng