bào MCF7
3.2.1. Kết quả thí nghiệm theo dõi sự tăng trưởng khối spheroid MCF7
Sau hai ngày tạo giọt treo với dòng MCF7, tiến hành hạ giọt treo và theo dõi sự tăng trƣởng của khối trong 25 ngày kể từ sau khi hạ giọt treo. Kết quả ghi nhận đƣợc cho thấy khối spheroid MCF7 có xu hƣớng phát triển mạnh về kích thƣớc từ ngày thứ 9 sau khi hạ giọt treo và tăng tiếp cho đến ngày thứ 17, sau đó giảm dần với tốc độ chậm hơn.
Bảng 14:Thể tích của khối spheroid MCF7 qua 25 ngày sau khi hạ giọt treo Ngày V (mm3) 5 3,13 7 3,37 9 3,94 11 6,11 13 8,88 15 13,64 17 16,48 19 14,10 21 13,79 23 13,50 25 12,43
Trong khoảng thời gian này, cấu trúc của khối spheroid cũng ổn định dần, viền đậm và rõ nét hơn, spheroid tròn hơn; cấu trúc lõi hoại tử xuất hiện từ ngày thứ 5 sau khi hạ giọt treo. Viền phân cách giữa lõi hoại tử với phần tế bào tăng sinh bên ngoài khối rõ dần, lõi hoại tử tăng dần diện tích một cách tƣơng quan với sự tăng thể tích khối. Sau ngày thứ 17, đi cùng với suy giảm kích thƣớc là cấu trúc khối spheroid trở nên bất ổn: viền ngoài không còn rõ nét, khối tròn mất dần, cấu trúc liên kết giữa các tế bào trong khối trở nên lỏng lẻo dần và các tế bào bong dần ra khối spheroid.
a b
c d
e f
Hình 42: Khối spheroid MCF7 trong 25 ngày quan sát kể từ khi hạ giọt treo (hình ảnh tại các thời điểm 5 (a), 9 (b), 13 (c), 17 (d), 21 (e) và 25 (f) ngày (400x)
3.2.2. Kết quả thí nghiệm kiểm tra tác động của Honokiol lên quá trình tạo khối spheroid MCF7 spheroid MCF7
Kết quả kiểm tra tác động của Honokiol lên dòng TBUT MCF7 trên mô hình 2D đơn lớp cho thấy: sau 24h đƣợc nuôi ổn định trên bề mặt đĩa nuôi cấy và 48h ủ với H thì tại nồng độ thứ ba (20µg/mL), các tế bào MCF7 đã bị ức chế mạnh mẽ. Mặt khác, trong thí nghiệm kiểm tra tác động của H lên sự hình thành khối spheroid MCF7, các tế bào MCF7 đƣợc nuôi trực tiếp trong môi trƣờng có chứa H ngay từ khi đang ở dạng huyền phù trong giọt treo nên các tế bào có thể sẽ mẫn cảm hơn với H. Bởi vậy, chúng tôi lựa chọn hai nồng độ 5 và 10µg/mL để tiến hành thí nghiệm này.
Sau hai ngày tạo giọt treo với môi trƣờng chứa H ở các nồng độ 5µg/mL và 10µg/mL, quan sát dƣới KHV chúng tôi nhận thấy: tất cả các giọt treo tạo bởi môi trƣờng chứa 10µg/mL H đều không tạo thành khối spheroid, các tế bào đƣợc đƣa vào tạo khối đã chết và nằm phân tán trong giọt treo. Điều này cho thấy H tác động mạnh đến tế bào MCF7 khi ở trạng thái huyền phù, so với kết quả kiểm tra tác động ở mô hình 2D thì ở nồng độ 10µg/mL, chỉ số tăng sinh của tế bào MCF7 hoàn toàn không bị suy giảm.
Với các giọt treo còn lại ở các mẫu ĐCSH và H nồng độ 5µg/mL đều hình thành giọt treo và chƣa thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa hai mẫu này. Tiến hành hạ giọt treo và theo dõi tiếp trong 07 ngày sau khi hạ giọt treo, kết quả quan sát đƣợc cho thấy tác động của H ở mẫu nồng độ 5µg/mL trở nên rõ rệt hơn. Ở ngày thứ 5, các khối spheroid ủ H có kích thƣớc tƣơng đƣơng với mẫu ĐCSH nhƣng lõi hoại tử đã xuất hiện rõ rệt hơn, chƣa có viền phân định rõ ràng với lớp tế bào tăng sinh bên ngoài. Đến ngày thứ 7, các tế bào ở khối lớp vỏ spheroid này đã tách ra khỏi cấu trúc khối, toàn bộ khối thu hẹp lại về kích thƣớc trong khi các khối spheroid ở mẫu ĐCSH vẫn tiếp tục tăng trƣởng bình thƣờng.
a b
c d
e
Hình 43: Khối spheroid MCF7 ở mẫu ĐCSH sau 5 (a) và 7 (b) ngày, ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL sau 5 (c) và 7 (d) ngày và không tạo khối khi ủ Honokiol NĐ 10µg/mL (e)
Nhƣ vậy, ở nồng độ 10µg/mL, H đã ức chế tăng sinh và gây chết tế bào MCF7. Các tế bào không liên kết với nhau để tạo thành khối cầu hay đám tế bào, điều này có thể là hệ quả của việc tế bào bị chết. Với nồng độ 5 µg/mL H, các tế bào MCF7 vẫn tạo đƣợc khối cầu sau 2 ngày tạo giọt treo, tuy nhiên, dƣới tác động
của H thì lõi hoại tử chứa các tế bào chết xuất hiện sớm hơn, lớn hơn so với mẫu ĐCSH cùng ngày và H cũng có tác động ức chế đến các tế bào ở lớp tăng sinh bên ngoài làm khối cầu không lớn lên bình thƣờng mà bị biến dạng, teo dần đi rồi các tế bào phân tách rời ra khỏi khối.
3.2.3. Kết quả thí nghiệm kiểm tra tác động của Honokiol lên sự tăng trưởng của khối spheroid MCF7 của khối spheroid MCF7
Với thí nghiệm kiểm tra tác động của H lên sự tăng trƣởng của khối spheroid MCF7, chúng tôi lựa chọn 2 nồng độ 10 và 20µg/mL (cao hơn so với nồng độ thử khả năng tạo khối spheroid, bao trùm giá trị IC50) do lúc này các khối spheroid sẽ đƣợc tạo thành sau 5 ngày hạ giọt mới tiến hành ủ thuốc, và các nghiên cứu cho thấy các tế bào trong khối spheroid có tính đề kháng tốt hơn với các hóa chất so với các tế bào cùng loại nuôi cấy đơn lớp. Kết quả bƣớc đầu cho thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa 3 mẫu ĐCSH, MCF7 ủ H NĐ 10µg/mL và MCF7 ủ H NĐ 20µg/mL.
Hình 44: Khối spheroid MCF7 mẫu ĐCSH sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x)
Hình 45: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 10µg/mL sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x)
Với mẫu ĐCSH, kích thƣớc và cấu trúc khối spheroid vẫn tăng trƣởng bình thƣờng và cho kết quả tƣơng đồng với thí nghiệm đã đề cập ở trên. Với mẫu ủ H NĐ 10µg/mL, đến ngày thứ 9 các khối spheroid đã có sự khác biệt rõ rệt với mẫu ĐCSH. Lõi hoại tử của khối spheroid với mẫu này lớn dần lên và viền phân cách với lớp tăng sinh bên ngoài mờ dần đi cho đến khi cả khối gần nhƣ sẫm đồng màu vào ngày thứ 15. Trong khi đó lớp tăng sinh bên ngoài cũng thể hiện sự bất ổn nhƣ viền xù xì, màu không còn sáng nhƣng vẫn giữ đƣợc một độ “đặc” nhất định của khối. Sau khi toàn bộ khối hoại tử thì các tế bào bắt đầu bong ra thành mảng.
Với mẫu ủ H nồng độ 20µg/mL, toàn khối spheroid thể hiện rõ rệt sự bất ổn khi lớp lõi hoại tử gần nhƣ không tăng lên về kích thƣớc trong khi lớp tế bào tăng sinh bên ngoài trở nên lỏng lẻo hơn dẫn đến sự tăng kích thƣớc của khối. Tuy nhiên, lớp tế bào này do tác động của H ức chế tăng sinh nên lớp tăng sinh này cũng chuyển màu xám dần và gần nhƣ ngừng tăng kích thƣớc từ ngày thứ 13. Sau ngày thứ 15, các khối này cũng bị phân rã.
Hình 46: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 20µg/mL sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x)
Bảng 15: Thể tích trung bình khối spheroid MCF7 trong 15 ngày theo dõi ủ với Honokiol
Ngày thứ Thể tích trung bình khối spheroid (mm3
) ĐCSH H 10ug/mL H 20ug/mL 3 2,03 2,15 2,42 5 3,07 3,08 2,94 7 5,09 3,21 4,77 9 7,61 5,45 5,47 11 8,51 6,55 5,16 13 10,91 8,44 5,95 15 12,46 10,84 5,11
Hình 48: Đồ thị tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 dưới ảnh hưởng của Honokiol (H)
Nhƣ vậy, các kết quả thử tác động của H lên quá trình tạo khối và sự tăng trƣởng của mô hình 3D spheroid tế bào ung thƣ vú MCF7 cho thấy H gây chết tế bào dẫn đến không tạo đƣợc khối spheroid ở nồng độ 10 µg/mL và ức chế tăng sinh của khối ở nồng độ 10 và 20 µg/mL. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các kết quả quan sát hình thái biến đổi cấu trúc của khối cũng đặt cho chúng tôi nghi vấn liệu H có tác động đến mối liên kết giữa các tế bào ung thƣ, từ đó làm lỏng lẻo cấu trúc của khối spheroid hay sự lỏng lẻo cấu trúc này đơn thuần là do độc tính của H với tế bào. Để giải đáp nghi vấn này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm kiểm tra tác động của H lên hệ thống vi sợi actin và tubulin của tế bào ung thƣ cổ tử cung Hela bằng phƣơng pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang (Immunofluoresence – IF).
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của Honokiol lên hệ vi sợi actin
Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Honokiol có ảnh hƣởng đến nhiều quá trình khác nhau trong tế bào nhƣ quá trình oxi hóa, chống viêm nhiễm, sự chết theo chƣơng trình ... Tuy nhiên cơ chế tác động cụ thể của Honokiol vẫn chƣa đƣợc hoàn toàn khám phá. Gần đây nhất có một số công bố về ảnh hƣởng của Honokiol lên quá trình tăng sinh mạch máu và sự di chuyển của tế bào. Trong đó Honokiol ảnh hƣởng đến sự tổ chức của các phân tử actin thành các cấu trúc liên quan đến sự vận động của tế bào.
Trong nghiên cứu này, khi quan sát tế bào xử lý với Honokiol, chúng tôi nhận thấy tế bào có sự thay đổi về kích thƣớc, khả năng trải rộng của tế bào kém, sự liên kết giữa các tế bào với nhau và với nền nuôi cấy bị giảm sút. Tất cả những biến đổi trên phần lớn liên quan đến actin – một loại protein quan trọng tạo nên cấu trúc bộ khung xƣơng tế bào. Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhuộm huỳnh quang miễn dịch tế bào HeLa với phalloidin gắn rhodamine. Phalloidin là chất chiết từ một loại nấm độc có tên là Amanita phalloides, có khả năng liên kết đặc hiệu với F-actin (chuỗi actin dạng sợi). Bằng cách sử dụng phalloidin gắn huỳnh quang chúng tôi có thể quan sát sự phân bố cũng nhƣ cách sắp xếp của sợi actin trong tế bào.
Kết quả cho thấy, quần thể tế bào HeLa sau khi ủ với Honokiol ở nồng độ 10 µg/mL có sự thay đổi rõ rệt. Từ cùng một lƣợng tế bào ban đầu, sau 48h xử lý với chất, các tế bào phân bố thƣa thớt và rời rạc hơn so với đối chứng (do không tăng
lên về số lƣợng, đồng thời xuất hiện các tế bào chết). Các tế bào phần lớn có dạng sợi chứ không trải rộng hình sao, chiều ngang bị thu hẹp nhiều so với đối chứng.
Hình 49: Ảnh hưởng của Honokiol lên hình thái tế bào Hela. Tế bào đối chứng (trái); Tế bào Hela ủ với Honokiol NĐ 10 µg/mL (phải); màu đỏ: actin; màu lam: nhân tế bào
Hình 50: Sự rối loạn phân bố của F-actin dưới tác động của Honokiol tại NĐ 10 µg/mL sau 48h ủ.
Khoảng cách giữa các tế bào lớn, đặc biệt giữa các tế bào cách xa nhau vẫn nối với nhau bởi các sợi actin kéo dài. Sự tồn tại của dạng cấu trúc này có thể do ảnh hƣởng của chất lên quá trình phân chia tế bào chất dẫn đến sự phân tách hai tế bào sau quá trình nguyên phân diễn ra không hoàn toàn, hai tế bào vẫn còn dính nhau bởi các sợi actin. Khi chuyển sang quan sát nhân, chúng tôi nhận thấy các tế bào có nhân bị biến đổi so với đối chứng: nhân cô đặc hơn, chia thành nhiều thùy hoặc thành nhiều mảng nhân tròn rời rạc có kích thƣớc khác nhau. Điều này có thể giải thích là do Honokiol gây ra hiện tƣợng apoptosis ở Hela.
Hình 51: Tế bào Hela sau 24h ủ với Honokiol tại NĐ 20µg/mL.
Hình phải: tế bào nhuộm với phalloidin-rhodamine (400x,); hình bên trái: tế bào nhuộm với phalloidin-rhodamine và tubulin – M488 (1000x)
Sự biểu hiện của F-actin trong tế bào cũng thay đổi: Trong khi ở các tế bào đối chứng, hệ sợi actin phân bố đều trên toàn bộ tế bào chất và màng tế bào, có thể quan sát đƣợc cấu trúc dạng sợi thì trên rất nhiều tế bào HeLa xử lý với Honokiol, có thể dễ dàng nhận thấy hệ thống sợi actin kém biểu hiện (tín hiệu huỳnh yếu hơn so với đối chứng), vùng tế bào chất tối màu, không quan sát đƣợc actin tồn tại ở dạng sợi căng. Một số tế bào vẫn biểu hiện nhiều F-actin, tuy nhiên các sợi actin trên các tế bào này lại tập trung nhiều ở màng tế bào hoặc thành các cụm chứ không phân bố thành dạng sợi và liên kết thành mạng lƣới nhƣ ở đối chứng. Chúng tôi
cũng quan sát thấy một số tế bào bị teo nhỏ chứa các đám F-actin đã biến đổi cấu trúc hoàn toàn. Đây chính là các tế bào đã chết.
Với mẫu Hela ủ Honokiol tại nồng độ 20µg/mL, chúng tôi nhận thấy hầu hết tế bào MCF7 gần nhƣ đã chết, các tế bào co tròn lại, actin không tồn tại thành hệ thống vi sợi nữa mà sáng rực thành từng điểm tế bào, nhân bị cô đặc và phân mảnh so với mẫu đối chứng. Ngay cả tubulin cũng không ở dạng vi ống một cách rõ rệt. Một số tế bào vẫn ràng buộc với nhau bởi các vi sợi và cả vi ống. Đây là điều bất thƣờng vì ở các cấu trúc liên kết bình thƣờng giữa các tế bào không có mặt của các microtubulin này.
Nhƣ vậy có thể thấy Honokiol đã ảnh hƣởng rõ rệt lên sự biểu hiện cũng nhƣ cách sắp xếp, phân bố của actin. Đồng thời sự tổ chức của actin cũng bị rối loạn, không tồn tại thành dạng mạng lƣới sợi mà co cụm thành tứng đám trên màng tế bào và cả ở trong tế bào chất. Đây có thể là nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi hình dạng và thu nhỏ kích thƣớc của tế bào.
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của Derrone lên sự phosphoryl hóa Histon H3 tại vị trí Serine 10 Histon H3 tại vị trí Serine 10
Cấu trúc hóa học của cả ba chất Honokiol, Magnonol và Derrone cung cấp bởi Viện Dƣợc liệu đều chứa một số nhóm cấu trúc tƣơng tự nhƣ các phân tử ức chế hoạt tính của enzyme Aurora kinaza đang đƣợc nghiên cứu hiện nay. Từ nhận định trên, chúng tôi tiến hành thử kiểm tra khả năng ức chế hoạt tính enzym Aurora kinaza của cả ba chất này. Histon H3 đƣợc phosphoryl hoá tại serine 10 bởi Aurora B trong quá trình phân bào (gọi tắt là H3PS10). Do đó, khả năng này đƣợc sử dụng nhƣ là một thƣớc đo hoạt tính của protein Aurora. Sự khởi đầu quá trình nguyên phân liên quan đến sự phosphoryl hoá H3 và quá trình này kéo dài đến tận kỳ cuối. Sự ức chế quá trình photphoryl hoá H3 tại serine 10 đƣợc xác định bằng kháng thể kháng đặc hiệu H3 photphoryl tại vị trí serine 10.
Trong các thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng hệ thống kính hiển vi laze quét đồng tụ LSM 510 (Zeiss) để quan sát và chụp ảnh.
Các mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm sẽ đƣợc tiến hành kiểm tra trên kính sơ bộ để xác định các thông số thích hợp về: độ mở ống nhận sáng (pinhole); độ phóng đại (zoom); cƣờng độ kích thích (lazer power). Sau đó, chúng tôi sẽ tiến hành chụp mẫu đối chứng và thí nghiệm với cùng một thông số đƣợc thiết lập. Tín hiệu huỳnh quang sẽ phụ thuộc vào độ mở ống nhận sáng và cƣờng độ laze kích thích. Do vậy việc giữ cùng thông số khi chụp sẽ đảm bảo so sánh đúng về biểu hiện của histone H3 photphoryl hóa tại serine 10. Đồng thời trong quá trình chụp, chúng tôi cũng xen kẽ chụp lại đối chứng để đảm bảo tín hiệu huỳnh quang giữa các mẫu không bị sai lệch theo thời gian nguồn laze đƣợc hoạt hóa.
Chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau: ở các tế bào đối chứng, toàn bộ tế bào phân chia ở các kỳ trƣớc, giữa, sau và cuối của pha M đều cho kết quả dƣơng tính với kháng thể H3PS10, nghĩa là sự phosphoryl hoá H3 diễn ra bình thƣờng. Chúng tôi cũng quan sát thấy một số tế bào không phân chia vẫn biểu hiện huỳnh