Histon H3 tại vị trí Serine 10
Cấu trúc hóa học của cả ba chất Honokiol, Magnonol và Derrone cung cấp bởi Viện Dƣợc liệu đều chứa một số nhóm cấu trúc tƣơng tự nhƣ các phân tử ức chế hoạt tính của enzyme Aurora kinaza đang đƣợc nghiên cứu hiện nay. Từ nhận định trên, chúng tôi tiến hành thử kiểm tra khả năng ức chế hoạt tính enzym Aurora kinaza của cả ba chất này. Histon H3 đƣợc phosphoryl hoá tại serine 10 bởi Aurora B trong quá trình phân bào (gọi tắt là H3PS10). Do đó, khả năng này đƣợc sử dụng nhƣ là một thƣớc đo hoạt tính của protein Aurora. Sự khởi đầu quá trình nguyên phân liên quan đến sự phosphoryl hoá H3 và quá trình này kéo dài đến tận kỳ cuối. Sự ức chế quá trình photphoryl hoá H3 tại serine 10 đƣợc xác định bằng kháng thể kháng đặc hiệu H3 photphoryl tại vị trí serine 10.
Trong các thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng hệ thống kính hiển vi laze quét đồng tụ LSM 510 (Zeiss) để quan sát và chụp ảnh.
Các mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm sẽ đƣợc tiến hành kiểm tra trên kính sơ bộ để xác định các thông số thích hợp về: độ mở ống nhận sáng (pinhole); độ phóng đại (zoom); cƣờng độ kích thích (lazer power). Sau đó, chúng tôi sẽ tiến hành chụp mẫu đối chứng và thí nghiệm với cùng một thông số đƣợc thiết lập. Tín hiệu huỳnh quang sẽ phụ thuộc vào độ mở ống nhận sáng và cƣờng độ laze kích thích. Do vậy việc giữ cùng thông số khi chụp sẽ đảm bảo so sánh đúng về biểu hiện của histone H3 photphoryl hóa tại serine 10. Đồng thời trong quá trình chụp, chúng tôi cũng xen kẽ chụp lại đối chứng để đảm bảo tín hiệu huỳnh quang giữa các mẫu không bị sai lệch theo thời gian nguồn laze đƣợc hoạt hóa.
Chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau: ở các tế bào đối chứng, toàn bộ tế bào phân chia ở các kỳ trƣớc, giữa, sau và cuối của pha M đều cho kết quả dƣơng tính với kháng thể H3PS10, nghĩa là sự phosphoryl hoá H3 diễn ra bình thƣờng. Chúng tôi cũng quan sát thấy một số tế bào không phân chia vẫn biểu hiện huỳnh quang, đây là các tế bào pha G2 chuẩn bị bƣớc vào giai đoạn M. Ta biết rằng tất cả các quá trình chuẩn bị cho phân chia đều diễn ra ở G2, trong đó có quá trình khởi động của sự cuộn xoắn nhiễm sắc thể, đó là lúc histone H3 bắt đầu đƣợc photphoryl hóa. Các tế bào phân chia sẽ co tròn lại, màng nhân tiêu biến. Các NST cuộn xoắn và biểu hiện mạnh H3PS10. Các tế bào ở kỳ trung gian trải rộng trên nền nuôi cấy, có dạng hình sao, không biểu hiện sự photphoryl hóa Histon H3. Một số tế bào biểu hiện là các tế bào ở pha G2 chuẩn bị bƣớc vào phân bào.
Trong số 03 mẫu chất thử tại nồng độ 10 µg/mL, chúng tôi nhận thấy có Derrone có biểu hiện rõ rệt sự ức chế H3P ở mức độ tế bào. Các tế bào phân chia dù ở cùng một pha lại có sự biểu hiện huỳnh quang rất khác biệt. Một số tế bào có tín hiệu rất mạnh, tƣơng đƣơng với đối chứng, trong khi đó một số biểu hiện yếu hoặc gần nhƣ không biểu hiện. Đặc biệt ở mẫu Derrone có sự giảm sút đáng kể tín hiệu huỳnh quang trên các tế bào ở cả ba kỳ: đầu (prophase), đầu-giữa (prometaphase) và kỳ giữa (metaphase). Chúng tôi đếm số lƣợng tế bào âm tính với tín hiệu huỳnh quang, hoặc tín hiệu yếu thì thu đƣợc tỷ lệ là 42% trên tổng số tế bào phân chia. Đối
tất cả các kỳ trong phân bào. Tỷ lệ tế bào biểu hiện yếu H3PS10 là 1,2 % ở mẫu Honokiol và 1,5 % ở mẫu Magnonol.
Hình 52: Sự biểu hiện H3PS10 tại các kỳ khác nhau trong quá trình phân chia của tế bào.
Derrone thuộc nhóm chất flavonoid, là nhóm chất có nhiều hoạt tính sinh học. Rất nhiều chất thuộc nhóm này đã và đang đƣợc ứng dụng trong điều trị ung thƣ. Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi cho thấy Derrone có ảnh hƣởng ức chế sự phosphoryl hóa histon H3 tại serine 10. Đây là cơ chất đã đƣợc chứng minh của enzyme Aurora B. Nhƣ vậy, có thể bƣớc đầu khẳng định Derrone mà chúng tôi sử dụng trong đề tài có khả năng ức chế hoạt tính của Aurora kinaza. Mặc dù độc tính
của chất này lên các dòng ung thƣ chƣa cao so với hai chất còn lại, nhƣng việc xác định đƣợc cơ chế tác động của chất sẽ dóng góp một phần quan trọng cho việc biến đổi chất để làm tăng hoạt tính của nó. Ở trƣờng hợp này đó là sự biến đổi cấu trúc để làm tăng tính cạnh tranh của chất với vị trí gắn ATP trên phân tử enzyme.
(a) (b)
(c) (d)
Hình 53: So sánh biểu hiện của H3PS10 tại các mẫu tế bào xử lý với Derrone (b); Magnonol (c); Honokiol (d) và mẫu đối chứng (a).
KẾT LUẬN
Từ nhƣng kết quả thí nghiệm và phân tích trên đây, chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau:
Honokiol có độc tính với dòng tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT 116, ung thƣ cổ tử cung Hela, ung thƣ vú MCF7 và KPL4 với chỉ số IC50 tƣơng ứng là 2; 31,63; 17,8 và 8,3 µg/mL (R2
>0,9). Magnolol có độc tính với dòng tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT116 và ung thƣ vú KPL4 với chỉ số IC50 tƣơng ứng là 0,2 và 14,8 µg/mL (R2
>0,9). Derrone có độc tính với dòng tế bào ung thƣ vú KPL4 với chỉ số IC50
là 17,8 µg/mL (R2 >0,9).
Honokiol có tác động ngăn cản quá trình tạo khối spheroid của tế bào MCF7 ở nồng độ 10µg/mL và ức chế tăng trƣởng khối này ở nồng độ 10 và 20 µg/mL.
Honokiol tác động đến sự biểu hiện cũng nhƣ các sắp xếp, phân bố của hệ thống vi sợi actin, làm tổ chức actin bị rối loạn, không tồn tại dạng mạng lƣới sợi mà co cụm thành từng đám trên màng tế bào và cả ở trong tế bào chất. Derrone có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme Aurora kinaza.
KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu thêm cơ chế tác động của Honokiol, Magnolol và Derrone lên tế bào.
Tiếp tục kiểm tra tác động của Honokiol, Magnolol và Derrone lên mô hình 2D, 3D các dòng tế bào ung thƣ khác và xem xét thử nghiệm trên mô hình in vivo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ahmedin Jemal, D., Phd, Freddie Bray P., Melissa M. Center M., Jacques Ferlay M., Elizabeth Ward P., and David Forman P. (2011), “Global Cancer Statistics”, CA: A Cancer Journal for Clinicians, 61, pp. 69–90.
2. Ahn, K.S., Sethi G., Shishodia S., Sung B., Arbiser J.L., and Aggarwal B.B. (2006), “Honokiol Potentiates Apoptosis, Suppresses Osteoclastogenesis, and Inhibits Invasion through Modulation of Nuclear Factor-κB Activation Pathway”, Molecular Cancer Research, 4 (9), pp. 621-633.
3. Bai, X., Cerimele F., et al. (2003), “Honokiol, a Small Molecular Weight Natural Product, Inhibits Angiogenesis in Vitro and Tumor Growth in Vivo”,
Journal of Biological Chemistry, 278 (37), pp. 35501-35507.
4. Chakraborty, B.S. (2001), “7 - Cancer drug development - Key regulatory considerations”, Health Administrator, 20, pp. 29-36.
5. Chen, Y., Wu C., et al. (2010), “Honokiol induces cell apoptosis in human chondrosarcoma cells through mitochondrial dysfunction and endoplasmic reticulum stress”, Cancer Letters, 291 (1), pp. 20-30.
6. Chiang, C.-K., Sheu M.-L., et al. (2011), “Honokiol ameliorates renal fibrosis by inhibiting extracellular matrix and pro-inflammatory factors in vivo and in vitro”, British Journal of Pharmacology, 163 (3), pp. 586-597. 7. Chiang, C., Sheu M., et al. (2011), “Honokiol ameliorates renal fibrosis by
inhibiting extracellular matrix and pro-inflammatory factors in vivo and in vitro”, British Journal of Pharmacology, 163 (3), pp. 586-597.
8. Dikalov, S., Losik T., and Arbiser J.L. (2008), “Honokiol is a potent scavenger of superoxide and peroxyl radicals”, Biochemical Pharmacology, 76 (5), pp. 589-596.
9. F, G., Ke G., and Eyers Pa E.A. (2006), “Validating Aurora B as an anti- cancer drug target”, Journal of Cell Science, 119 (36), pp. 64-75.
10. Fedoreyev, S.A., Bulgakov V.P., et al. (2008), “Isoflavonoid Composition of a Callus Culture of the Relict Tree Maackia amurensis Rupr. et Maxim”,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56 (16), pp. 7023-7031.
11. Freshney, R.I. (2005), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5thth edition, Willey Blackwell.
12. Garcia, A., Zheng Y., et al. (2008), “Honokiol Suppresses Survival Signals Mediated by Ras-Dependent Phospholipase D Activity in Human Cancer Cells”, Clinical Cancer Research, 14 (13), pp. 4267-4274.
13. Giet, R., Petretti C., and Prigent C. (2005), “Aurora kinases, aneuploidy and cancer, a coincidence or a real link? ”, Trends in Cell Biololy, 15, pp. 241- 250.
14. Hanahan, D. and Weinberg Robert a. (2011), “Hallmarks of Cancer: The Next Generation”, Cell, 144 (5), pp. 646-674.
15. Hu, L., Hofmann J., Lu Y., Mills G.B., and Jaffe R.B. (2002), “Inhibition of Phosphatidylinositol 3′-Kinase Increases Efficacy of Paclitaxel in in Vitro and in Vivo Ovarian Cancer Models”, Cancer Research, 62 (4), pp. 1087- 1092.
16. Ja, P.F., D R., S R., E R.-B., and A C. (2009), “Aurora kinase inhibitors: a new class of drugs targeting the regulatory mitotic system”, Clinical & Translational Oncology, 11 (12), pp. 787-798.
17. Kim, S.C., Kim D.W., et al. (2001), “In vivo evaluation of polymeric micellar paclitaxel formulation: toxicity and efficacy”, Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 72 (1-3), pp. 191- 202.
18. Kurebayashi, J., Otsuki T., et al. (1999), “Isolation and characterization of a new human breast cancer cell line, KPL-4, expressing the Erb B family receptors and interleukin-6”, British journal of cancer, 79 (5-6), pp. 707-717. 19. Leeman-Neill, R.J., Cai Q., et al. (2010), “Honokiol Inhibits Epidermal Growth Factor Receptor Signaling and Enhances the Antitumor Effects of Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitors”, Clinical Cancer Research, 16 (9), pp. 2571-2579.
20. Leeman-Neill, R.J., Cai Q., et al. (2010), “Honokiol inhibits epidermal growth factor receptor signaling and enhances the antitumor effects of epidermal growth factor receptor inhibitors”, Clinical Cancer Research, 291 (1), pp. 20-30.
21. Li, Z., Liu Y., et al. (2008), “Honokiol, a natural therapeutic candidate, induces apoptosis and inhibits angiogenesis of ovarian tumor cells”,
European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology, 140 (1), pp. 95-102.
22. Lin, Y., Chen H., Ko C., and Chan M. (2007), “Effects of honokiol and magnolol on acute and inflammatory pain models in mice”, Life Science, 81 (13).
23. Lin, Y., Chen H., Ko C., and Chan M. (2007), “Effects of honokiol and magnolol on acute and inflammatory pain models in mice”, Life Science, 81, pp. 1071 - 1078.
24. Lisa A. Gurski, B., Nicholas J. Petrelli M., Xinqiao Jia P., and Mary C. Farach-Carson P. (2010), “3D matrices for anti-cancer Drug testing and Development”, Oncology Issues, January/February.
25. Liu, S.H., Shen C.C., et al. (2010), “Honokiol inhibits gastric tumourigenesis by activation of 15-lipoxygenase-1 and consequent inhibition of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and COX-2-dependent signals”,
British Journal of Pharmacology, 160 (8), pp. 1963-1972.
26. Liu, Y., Chen L., et al. (2008), “Enhancement of therapeutic effectiveness by combining liposomal honokiol with cisplatin in ovarian carcinoma”,
International Journal of Gynecological Cancer, 18 (4), pp. 652-659.
27. Masters, J.R.W. (2002), Cancer cell lines, Vol. I, II, III, Kluwer Academic Publishers.
28. Mayer, B., Klement G., et al. (2001), “Multicellular gastric cancer spheroids recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric carcinomas”, Gastroenterology, 121 (4), pp. 839-852.
29. Miller, K., Wang M., et al. (2007), “Paclitaxel plus Bevacizumab versus Paclitaxel Alone for Metastatic Breast Cancer”, New England Journal of Medicine, 357 (26), pp. 2666-2676.
30. Minchinton, A.I. and Tannock I.F. (2006), “Drug penetration in solid tumours”, Nature Reviews Cancer, 6 (8), pp. 583-592.
31. Ota, T., Suto S., et al. (2002), “Increased mitotic phosphorylation of histone H3 attributable to AIM-1/Aurora-B overexpression contributes to chromosome number instability”, The Journal of Cancer Research, 62, pp. 5168-5177.
32. Panno, J. (2005), Cancer: The Role of Genes, Lifestyle, and Enviroment, Facts on File.
33. Ponnurangam, S., Mammen J.M.V., et al. (2012), “Honokiol in combination with radiation targets notch signaling to inhibit colon cancer stem cells”,
Molecule Cancer Therapy, 11 (4), pp. 963-972.
34. Rolf Bjerkvig, P.D. (1992), Spheroid culture in cancer research, 1th edition, Informa Healthcare.
35. Rowinsky, E.K. and Donehower R.C. (1995), “Paclitaxel (Taxol)”, New England Journal of Medicine, 332 (15), pp. 1004-1014.
36. Ruddon, R.W. (2007), Cancer Biology, 4thth edition, Oxford University Press.
37. S., R., M. C., and Wc. E. (2007), “Chromosomal passengers conducting cell division”, Nature Reviews Molecular Cell Biology, (8), pp. 798-812.
38. Shen, J.-L., Man K.-M., et al. (2010), “Honokiol and Magnolol as Multifunctional Antioxidative Molecules for Dermatologic Disorders”,
Molecules, 15 (9), pp. 6452-6465.
39. Teicher, B.A. (1997), Anticancer Drug Development Guide.
40. Teicher, B.A. (2001), Tumour Models in Cancer Research, Cancer Drug Discovery and Deverlopment, ed. B.A. Teicher, Human Press, New Jersey. 41. Vader G., L.S. (2008), “The aurora kinase family in cell division and
42. Vavilala, D.T., Ponnaluri V.K.C., Vadlapatla R.K., Pal D., Mitra A.K., and Mukherji M. (2012), “Honokiol inhibits HIF pathway and hypoxia-induced expression of histone lysine demethylases”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 422 (3), pp. 369-374.
43. Wang, T.-H., Wang H.-S., and Soong Y.-K. (2000), “Paclitaxel-induced cell death”, Cancer, 88 (11), pp. 2619-2628.
44. Wu, S.-N., Yeh C.-C., Huang H.-C., and Yang W.-H. (2011), “Effects of Honokiol on Membrane Electroporation-Induced Inward Current in Pituitary Tumor (GH3) Cells ”, Journal of Natural Products, 4, pp. 115-124
45. Wu, X., Chen X., and Hu Z. (2003), “High-performance liquid chromatographic method for simultaneous determination of honokiol and magnolol in rat plasma”, Talanta, 59 (1), pp. 115-121.
46. Xu, H., Tang W., Du G., and Kokudo N. (2011), “Targeting apoptosis pathways in cancer with magnolol and honokiol, bioactive constituents of the bark of Magnolia officinalis”, Drug Discoveries & Therapeutics, 5 (5), pp. 202-210.
47. Zang, R., Li D., Tang I.-C., Wang J., and Yang S.-T. (2012), “Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery”, International Journal of Biotechnologyfor WellnessIndustries, 1, pp. 31-51.