A. xylinum là vi khuẩn không có khả năng quang hợp. Trong môi trường tự nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào, màng BC là một ví dụ. Những tế bào vi khuẩn sản xuất cellulose được bẫy bên trong mạng lưới polymer. Mạng lưới này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí. Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose. Một vài tác giả
38
cho rằng, cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum còn đóng vai trò tích trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo-glucanase hay endo-glucanase, sự hiện diện cả hai loại enzyme này được phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài chủng A. xylinum sản xuất cellulose. Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi bất lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc, và các vi sinh vật gây bệnh. Các vi khuẩn A. xylinum có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao. Cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% tế bào A. xylinum được bao BC sống sót sau 1 giờ xử lý tia cực tím. Tách BC khỏi tế bào, khả năng sống của tế bào giảm đáng kể, chỉ còn 3%.
2.5.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men tạo BC
Phƣơng pháp lên men: Ngày nay, sản xuất BC được thực hiện bằng nhiều phương pháp lên men khác nhau như nuôi cấy lắc, nuôi cấy tĩnh trên khay… Việc lựa chọn phương pháp nào để thực hiện là tùy thuộc vào định hướng ứng dụng vì sản phẩm BC sẽ có đặc tính hóa lý và cấu trúc khác nhau ứng với từng phương pháp khác nhau. Khi nuôi cấy tĩnh hay bề mặt, màng BC (S-BC) được tích lũy trên bề mặt môi trường nuôi. S-BC thương mại thông dụng như Nata-de Coco, màng rung truyền âm thanh, làm màng trị bỏng… Còn khi nuôi cấy lắc thì BC (A-BC) sẽ có dạng sợi huyền phù, hay dạng khối không đồng nhất (dạng hột nhỏ, hoặc hình cầu, hình elip). Kiểu nuôi này thích hợp hơn cho sản xuất BC công nghiệp và cho các ứng dụng khác của A-BC như: mỹ phẩm, vật liệu, chất nhũ hóa… Kiểu lên men BC này chưa được nghiên cứu và tiến hành ở Việt Nam. Theo các nhà nghiên cứu thì phương pháp nuôi cấy chìm cho hiệu suất sinh tổng hợp BC cao hơn vì các thiết bị lên men chìm có thể cung cấp tốt lượng oxy cho tế bào hoạt động. Đồng thời BC này còn có khả năng giữ nước cao hơn từ phương pháp tĩnh. Tuy nhiên, trở ngại ở đây là thường phát sinh các chủng đột biến
Cel- một cách ngẫu nhiên sau thời gian lên men. Các chủng Cel- này sẽ không còn khả
năng sản sinh BC nữa, vì thế làm hiệu suất BC giảm đáng kể.
Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu cho sản sinh cellulose là 25-300C.
Giá trị pH: Nhìn chung, khoảng pH tối ưu để sản sinh BC là 4-7. Theo Hestrin và Schramm (1954) cho rằng pH dưới 7 là quan trọng hơn cả. Còn Fiedler và cộng sự thì cho pH từ 5-7 thì tối ưu. Hầu hết pH bằng 5 hay 6 được dùng trong các nghiên cứu. Nhưng để sản xuất cellulose công nghiệp thì pH từ 4-4,5 thì cho kết quả ưu thế hơn do giảm sự tạp nhiễm. A. xylinum đồng thời cũng sản xuất ra 2 loại: enzyme cellulase và bacterial cellulose. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, tuy đồng thời cùng sản xuất 2 loại: cellulose và cellulase nhưng có thể khống chế độ pH của môi trường dinh dưỡng để điều chỉnh mức độ sản sinh ra 1 trong 2 loại này. Khi pH ở mức từ 4 - 4,5 thì lượng BC được sản sinh ra nhiều nhất, còn pH ở mức từ 5 – 5,5 thì lượng enzyme cellulase được sản sinh cao hơn. Theo S. Hestrin và M. Schramm (1954), HCl và NaOH thích hợp dùng để điều chỉnh pH môi trường.
Nồng độ oxy: Nồng độ O2 liên quan trực tiếp đến việc sinh tổng hợp BC. Khi không khí giàu O2 (duy trì nồng độ lớn hơn 39%) được cho vào tại thời điểm 8h sau khi nuôi
39
cấy thì sản lượng BC tăng lên 1,5 lần và năng suất BC tăng từ 11% lên đến 18%. Tuy nhiên, với nồng độ O2 như thế, nhưng cho vào từ khi bắt đầu nuôi cấy thì số lượng tế bào suy giảm một cách nhanh chóng và hầu như vi khuẩn không sản sinh BC nữa. Điều này tác giả giải thích vì số lượng tế bào sống sót tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy quá thấp nên không thể tìm thấy BC trong điều kiện nồng độ O2 hòa tan cao (vì trong điều kiện này đã làm ức chế vi khuẩn). Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, tại nồng độ O2 10% và 15% một vài chủng A. xylinum cho sản lượng BC cao hơn ở nồng độ O2 là 20%. Khi nồng độ O2 tăng đến 30% sẽ làm giảm đáng kể sản lượng BC trong khi sự tăng trưởng của tế bào vẫn tiếp tục duy trì.
Nguồn dinh dƣỡng carbon: Những cơ chất được đánh giá là cho sản lượng BC cao, bao gồm: glucose, sorbitol và manitol. Glycerol, galactose, lactose, sucrose và maltose được xem là cơ chất thích hợp. Những cơ chất mà vi khuẩn này không có khả năng sử dụng để tạo màng cellulose là sorbose, mannose, cellobiose, erythritol, ethanol và acetate. Nguồn carbon từ glucose được cho là thích hợp trong việc tăng hiệu suất khả năng sản sinh BC.
Nguồn dinh dƣỡng nitrogen: Môi trường được dùng để nghiên cứu là môi trường có 0,5% cao nấm men và 0,5% pepton. Đối với một số dòng A. xylinum lại cho thêm tryptophan, dịch chiết ngô vào trong môi trường. Tuy nhiên dịch chiết ngô cho hiệu quả hơn cả. Các acid amin như methionin, glutamate thì luôn cần phải có trong môi trường vì những acid amin này có ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển của tế bào và sự tổng hợp cellulose. Người ta tìm ra ammonium dihydrogen phosphate có thể được sử dụng thay cho cao nấm men như một nguồn cung cấp nitơ và thêm vào một lượng nhỏ dịch chiết bột bắp (từ 0,125 tới 0,5 ml/l) thì gia tăng sản lượng BC.
2.5.5 Các ứng dụng của bacterial cellulose
Vì bacterial cellulose có những đặc tính như mức độ tinh khiết cao, độ kết tinh cao, mật độ dày, khả năng giữ cấu trúc tốt, khả năng hút nước và chứa nước mạnh và diện tích bề mặt riêng lớn khi so sánh với các loại cellulose thực vật, nên người ta đã áp dụng nó trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp dệt nhuộm, giấy, thực phẩm, y dược, xử lý chất thải, truyền thông, hầm mỏ và tinh sạch hoá chất. Ta có thể liệt kê một số ứng dụng phổ biến như sau:
Thực phẩm: về mặt hoá học, cellulose được sử dụng trong các quy trình chế biến thực phẩm với chức năng làm đông đặc và ổn định cấu trúc. Ứng dụng đầu tiên phải kể đến là làm thạch dừa (nata de coco). Do thạch dừa có cấu trúc giống như gel và hoàn toàn không tiêu trong đường tiêu hoá, nên nó có tác dụng tương tự các chất xơ, rất hữu ích cho hệ tiêu hoá. Ở Philippine và nhiều nước khác, người ta còn chế biến bacterial cellulose thành dạng bánh snack rất được ưa chuộng. Kể từ năm 1970, khi phát hiện ra hợp chất monacolin K (mevinolin) từ loài nấm Monascus có khả năng kìm hãm quá trình sinh tổng hợp cholesterol, người ta đã kết hợp giữa thạch dừa và monacolin K thành một loại thực phẩm chức năng có tên là monascus-nata. Ngoài ra, vì đặc tính vượt trội về bề mặt mềm mại và hệ sợi cao nên bacterial cellulose còn được ứng dụng rộng rãi trong các quy trình chế biến thực phẩm khác. Đến năm 1992,
40
bacterial cellulose được đưa vào thức uống dành cho người ăn kiêng ở Nhật Bản.
Acetobacter cũng được ứng dụng cùng với nấm men trong sản phẩm dịch chiết trà (tea extract) có bổ sung đường, sản phẩm này gọi là kombucha hay là trà Manchurian, giúp cải thiện sức khoẻ người sử dụng [5].
Y dƣợc: bacterial cellulose chịu được lực kéo căng cao, có độ xốp cao và cấu trúc vi sợi nên được ứng dụng trong y dược rất nhiều. Đối với các bệnh kinh niên như lở loét ở chân, nằm liệt giường và hoại tử vì bệnh đái tháo đường thì rất khó chữa trị, những bệnh này trở thành những thử thách lớn cho cả bệnh nhân và ngành chăm sóc sức khoẻ. Việc chữa trị những bệnh trên liên quan đến nhiều giải pháp sử dụng các chất mang khác nhau (hydrocolloid, hydrogel, màng sinh học hoặc màng tổng hợp) nhằm cung cấp một trạng thái môi trường có độ ẩm cao giúp chữa trị vết thương đạt hiệu quả. Ngày nay đối với những vật liệu bao vết thương người ta yêu cầu phải tương tự như một loại da nhân nhân tạo, cả về cấu trúc lẫn chức năng. Vật liệu này không gây độc, không sinh nhiệt và tương hợp với cơ thể, có khả năng chống nhiễm trùng, giảm sự rò rỉ bởi dịch ở vết thương, giảm sự đau đớn trong quá trình điều trị, dễ dàng bao kín vết thương, dễ chuyển hoặc tiêm thuốc vào vết thương, khả năng hấp thu mạnh dịch khi vết thương bị viêm, độ bền kéo cao, dễ co giản và tạo cảm giác thoải mái, dễ tạo hình ứng với các vết thương khác nhau và không gây đau đớn khi bao vết thương. Cellulose từ vi khuẩn do có cấu trúc xốp nên nó cho phép chuyển những loại thuốc trực tiếp vào vết thương thông qua việc tiêm, đồng thời nó lại là một lớp bảo vệ tránh sự xâm nhiễm vi sinh vật. Khả năng giữ nước của cellulose vi khuẩn rất cao, cùng với hệ sợi nhỏ hơn 100 lần so với hệ sợi từ cellulose thực vật. Công ty Biofill (Brazil) đã đầu tư vào lĩnh vực này và cho ra đời 2 sản phẩm là Bioprocess và Gengiflex, dùng trong bao bọc vết thương ngoài. Một chế phẩm cellulose vi khuẩn khác là Prima Cel, được sản xuất bởi công ty Xylos (Mỹ) cũng đã áp dụng thử nghiệm trên quy mô lớn.
Hình 37. (a) hệ vi sợi ở BC và (b) ở thực vật, độ phóng đại x5000 [5]
2.6Nghiên cứu về hệ vi khuẩn nitrate hoá và ứng dụng
Năm 2009, Manju và cộng sự ở trung tâm quốc gia về động vật biển, Ấn Độ đã nghiên cứu và đưa ra quy trình cố định hệ vi khuẩn nitrate hoá lên bột gỗ của cây thân thảo Ailantus altissima (300-1500µm) nhằm chuyển hoá lượng ammonia trong nước nuôi tôm sang nitrate. Chế phẩm có tên thương mại là TANOX (Total Ammonia Nitrogen Oxidizer). Giống vi sinh vật được phân lập từ tự nhiên và từ trong các bể nuôi tôm, được Achuthan và cộng sự tuyển
41
chọn năm trong một công trình nghiên cứu vào năm 2006. Thời gian cố định theo phương pháp thủ công bẫy-hấp phụ là 72h thì chế phẩm có hoạt lực nitrate hoá cao nhất. Ngoài ra, các tác giả cũng chế tạo một thiết bị khuấy đảo hoạt động theo mẻ giúp nâng cao năng suất và hiệu suất cố định.
Sau các thí nghiệm, nhóm nghiên cứu đã tìm ra các thông số sau:
Đối với các chủng vi khuẩn nitrate hoá: được nuôi thu sinh khối ở fermentor 2 L trong 7 ngày bằng môi trường Watson (1965). Khi đó, hoạt lực nitrate hoá của 4 chủng vi khuẩn đạt cao nhất. Lượng ammonia chuyển hoá là 4,0±0,53 mg/L.ngày (vi khuẩn nitrite hoá, phân lập từ tự nhiên) và 6,2±0,78 mg/L.ngày (vi khuẩn nitrite hoá, phân lập từ ao nuôi). Lượng nitrite chuyển hoá là 5,37±1,2 mg/L.ngày (vi khuẩn nitrate hoá, phân lập từ tự nhiên) và 6,89±0,98 mg/L.ngày (vi khuẩn nitrate hoá, phân lập từ ao nuôi).
Đối với chất mang: sau khi xử lý lignin theo phương pháp của Wood và Saddler (1988), sẽ được nghiền nhỏ ra đạt kích thước 300-1500 µm, có diện tích bề mặt 1,87 m2/g.
Chế phẩm sau khi được cố định, nếu bảo quản ở nhiệt độ phòng thì khả năng nitrate hoá giảm đi phân nửa.
Phương pháp cố định: người ta nuôi thu sinh khối cả 4 chủng vi khuẩn nitrate hoá chung một thiết bị, sau đó tiến hành bẫy-hấp phụ với bột gỗ. Kết quả là với nồng độ tế bào ban đầu 105 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tế bào/ml thì 1 gam chế phẩm sau cố định trong 3 ngày sẽ có hoạt lực nitrtate hoá cao nhất.
Sử dụng chế phẩm như sau: dùng 0,2 g chế phẩm ứng với 20 L nước biển cần xử lý, mức độ chuyển hoá ammonia đạt trung bình 2,4 mg/L trong 3 ngày đầu tiên. Trong các thí nghiệm, sản phẩm nitrate hoá tạo thành (NO3-) không phát hiện được do quá trình phản nitrate hoá bởi các chủng vi sinh vật khác trong nước. Điều này cho thấy chế phẩm TANOX có thể xem như giúp loại bỏ nitrogen trong nước triệt để (thành khí nitơ thoát ra ngoài), mặc dù bản chất chỉ là chuyển từ ammonia sang nitrate.
Hình 38. Hình chụp dươi kính hiển vi điện tử những mẫu gỗ A. altissima đã được loại lignin. A và B: kích thước mẫu 300-500µm. C và D: kích thước mẫu 500-710µm [10]
42
Hình 39. Chế phẩm sau khi cố định, kích thước 300-1500µm. Thời gian cố định lần lượt là A: 6h, B: 12h, C: 24h và D: 72h [10]
Hình 40. Thiết bị cố định dạng khuấy đảo, dung tích 50L. Sau 4 ngày cố định, khả năng nitrate hoá của chế phẩm đạt cao nhất [10]
Hình 41. Đồ thị thể hiện hoạt lực nitrate hoá của chế phẩm theo thời gian. Tiến hành thí nghiệm lặp lại 3 lần [10]
43
CHƢƠNG 3. NGHIÊN CỨU TÌNH HUỐNG
3.1Qui trình thực hiện Nitrosomonas sp. Nitrosomonas sp. Nitrobacter sp. Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2 Acetobacter xylinum Nhân giống Tạo giá thế BC Xử lý phù hợp Cố định VSV
Kiểm tra mẫu Mẫu nước thí nghiệm
Xác định chỉ tiêu hoá lý
Xác định hoạt lực nitrate hoá của chế phẩm
Kết quả và bàn luận
Sơ đồ 1. Quy trình cố định hệ vi khuẩn nitrate hóa lên BC và thử nghiệm chế phẩm.
3.2Tạo chất mang BC
Giống Acetobacter xylinum do Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa kỹ thuật Hoá học, trường Đại học Bách Khoa TPHCM cung cấp.
Môi trƣờng giữ giống (thạch nghiêng)
Glucose 20 g/l
Ammonium sulfate (SA) (NH4)2SO4 8 g/l Diammonium phosphate (DAP) (NH4)2HPO4 2 g/l
44
Agar 20 g/l
Không cho acid acetic
Khử trùng 1210C trong 20 phút
Môi trƣờng nhân giống cấp 1, cấp 2
Glucose 20 g/l
Ammonium sulfate (SA) (NH4)2SO4 8 g/l Diammonium phosphate (DAP) (NH4)2HPO4 2 g/l
Nước dừa già 1 lít
Acid acetic đậm đặc 5 ml/l
Khử trùng 1210C trong 20 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi trƣờng lên men thu BC
Glucose 20 g/l
Ammonium sulfate (SA) (NH4)2SO4 8 g/l Diammonium phosphate (DAP) (NH4)2HPO4 2 g/l
Nước dừa già 1 lít
Acid acetic đậm đặc 5 ml/l
Thanh trùng 1000C trong 2 phút
Hình 42. Quan sát tế bào Acetobacter xylinum dưới kính hiển vi để kiểm tra các đặc điểm vi thể
45
Hình 44. Sau khi đảm bảo chắc chắn giống đang có là Acetobacter xylium thì từ ống giống gốc (A) ta cấy chuyền qua ống thạch nghiêng (B), nếu thao tác không đúng sẽ dẫn đến
tạp nhiễm (C)
Hình 45. Cùng với việc cấy chuyền, ta sẽ tiến hành nhân giống cấp 1 trong ống nghiệm. (1+2) lớp màng BC tạo ra sau 5 ngày nhân giống, (3) các tế bào kết thành dải màu nâu nhạt
Hình 46. Tiến hành nhân giống cáp 2, sau khi cấy giống vào erlen chứa môi trường ở bình (A), để yên erlen ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 5 ngày sẽ thấy xuất hiện lớp màng mỏng
46
Hình 47. Tiến hành lên men thu BC bằng cách cấy vào khay nhựa chứa môi trường lên men (A), sau 7 ngày ta sẽ thu được sản phẩm (B).
Hình 48. Trong quá trình lên men, nếu nguyên liệu nước dừa già đã bị nhiễm bào tử nấm mốc thì khả năng mốc mọc lên khi lên men là rất cao. Ngoài ra, nguyên nhân tạp nhiễm còn do rửa
dụng cụ không sạch và khay bị hở nắp nên bào tử nấm lọt vào
3.3Lên men thu sinh khối hệ vi khuẩn nitrate hoá
Giống vi khuẩn được phân lập từ chế phẩm vi sinh do viện Thuỷ Sản II cung cấp.
Môi trƣờng nhân giống và lên men Nitrosomonas sp.
(NH4)2SO4 3 g/l K2HPO4 0,5 g/l MgSO4 0,05 g/l CaCl2 0,04 g/l