Hệ vi khuẩn nitrate hoá được biết có khuynh hướng tiết ra những polymer ngoại bào và dính vào chất mang. Khi chất mang có lớp lipopolysaccharide phủ bên ngoài thì sự bám dính được tốt hơn. Nếu bề mặt chất mang không phù hợp và nếu có nước rửa trôi, những cụm tế bào sẽ hình thành, gọi là zoogloeas. Màng sinh học (biofilm) tạo bởi vi khuẩn nitrate hoá có khối lượng riêng ướt đạt 1,14 g/cm3 và tổng khối lượng riêng khô là 0,03 g/cm3. Trong nguồn nước tự nhiên, vi khuẩn nitrite hoá thường kết với nhau thành từng chùm và nổi trên bề mặt hơn là ở dạng tự do. Diab và Shilo (1988) đã chứng minh vi khuẩn nitrate hoá có thể bám dính từ 70-95% lên một bề mặt mịn, trơ sau 30 phút kể từ khi cho tiếp xúc.
Tác động tích cực của chất mang lên hoạt động sinh lý của hệ vi khuẩn nitrate hoá hiện vẫn còn khá bí ẩn. Powell và Prosser (1986) ghi nhận là quá trình nitrate hoá ở trong đất, đá sẽ ít nhạy cảm hơn 10 lần so với quá trình nitrate hoá xảy ra trong nước nếu dùng cùng nitrapyrin làm chất ức chế. Abeliovich (1987) nhận thấy số lượng tế bào của Nitrosomonas sp. giảm nhanh trong điều kiện kị khí ở dịch tế bào tự do so với tế bào nằm trong lớp bùn, được ghi nhận khả năng sống sót trong hàng tháng. Diab và Shilo (1988) cũng chứng minh khả năng tồn tại mạnh mẽ của vi khuẩn nitrate hoá trong điều kiện cố định ở các chế độ kị khí và thiếu nguồn dinh dưỡng. Audic và cộng sự (1984) khám phá ra hoạt động hô hấp nitrate hoá của vi khuẩn cố định trong cột sẽ tăng đến 130% so với bình thường, và tốc độ nitrate hoá tăng rất mạnh trong giờ đầu tiên. Bởi vì hoạt động nitrate hoá và khả năng sống sót sẽ rất thấp nếu vi khuẩn ở dạng tự do, vì thế yêu cầu cần phải cố định là cần thiết, việc tạo ra những chất mang nhân tạo sẽ nhân hiệu quả của quá trình nitrate hoá tự nhiên lên rất cao.
28 2.4Thu sinh khối Nitrosomonas europaea theo mẻ (batch) và liên tục
Năm 1960, các nghiên cứu hoá sinh về các phản ứng oxi hoá ammonia thành nitrous acid ở vi khuẩn Nitrosomonas đã đặt ra yêu cầu là phải luôn có sẵn sinh khối vi khuẩn, nhưng vì loài vi sinh vật này có thời gian tăng sinh khối rất lâu nên là một trở ngại trong việc mở rộng quy mô thí nghiệm. Vì thời điểm ấy các nghiên cứu về quá trình nuôi cấy chỉ mới dừng lại ở chỗ phân lập và giữ giống, chứ chưa đi sâu vào việc tối ưu các quá trình lên men thu sinh khối, chính vì vậy Skinner và Walker đã bắt tay vào thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng các cấu tử trong môi trường nuôi cấy (Ca, Mg, K, Co, Mn, Zn…) cũng như chế độ batch và liên tục sẽ tác động như thế nào đến sự sinh trưởng của vi khuẩn [14].
Cũng cần lưu ý là vào năm 1958, Engel và Alexander trong bài viết về nuôi cấy vi khuẩn Nitrosomonas europaea đã đưa ra đường cong sinh trưởng của vi khuẩn này, và sản phẩm trao đổi chất NO2- đo được thì trùng với quá trình phát triển nó. Do đó, có một cách để định lượng sự sinh trưởng của loại vi khuẩn này là thông qua sản phẩm trao đổi chất tạo thành.
Hình 31. Sự tạo thành nitrite trong quá trình sinh trưởng của N. europaea trên môi trường được cấy 4% dịch giống và hàm lượng ammonia ban đầu là 7,8 mM [12]
29 2.4.1 Bố trí thí nghiệm
Đối với giống vi sinh vật, Skinner sử dụng dòng Nitrosomonas europaea được Jensen phân lập ở Đan Mạch. Họ xem giống vi khuẩn này là thuần chủng sau khi kiểm tra bằng các phương pháp sau: (1) cấy tràn vi khuẩn vào đĩa pertri chứa peptone và ủ ở 300C trong điều kiện hiếu khí, sau 6 ngày không ghi nhận bất kì khuẩn lạc nào mọc lên; (2) khi quan sát hình thái tiêu bản giọt treo, không phát hiện thấy các dạng dị hình cũng như kiểm tra bằng phương pháp nhuộm Gram, thấy đó là vi khuẩn không di động, dạng que, Gram âm.
Nếu trong giống đã bị nhiễm tạp khuẩn hoặc thậm chí các loài vi sinh vật hoá sinh dị dưỡng khác (thường là các loài nấm có khả năng dùng NH3 như nguồn cơ chất), ta sẽ phân lập lại qua hai bước: đầu tiên dùng phương pháp đổ hộp như đếm khuẩn lạc, sau đó lấy cấy các khuẩn lạc đó vào erlen chứa môi trường thích hợp. Sau 3 tuần, ủ ở nhiệt độ 250C, erlen nào có lượng ammonia bị giảm (định lượng bằng phương pháp đo ammonia) thì sẽ đem ra để thử trên môi trường thạch chứa peptone, nếu không phát hiện bị nhiễm tạp khuẩn thì erlen đó chứa dòng Nitrosomonas thuần.
Nuôi cấy trong erlen: thành phần các loại muối tinh khiết trong 1 lít môi trường sử dụng nước cất là: 0,5g (NH4)2SO4; 0,07g KH2PO4; 0,05g MgSO4.7H2O; 0,05g CaCl2.2H2O, sau khi pha xong sẽ tiệt trùng môi trường. Ta cho 4ml dung dịch Na2CO3 5% w/v đã tiệt trùng vào môi trường nhằm điều chỉnh pH về 8,0. Kinh nghiệm cho thấy là hàm lượng các loại muối có thể khác nhau nhưng không làm ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn, chỉ có lượng CaCl2 và MgSO4.7H2O cần phải cân chính xác nhằm tránh kết tủa các muối phosphate khi môi trường được chỉnh về pH kiềm.
Nuôi cấy trong fermenter: thành phần các loại muối tinh khiết trong 1 lít môi trường sử dụng nước cất là: 1÷8 g (NH4)2SO4; 0,4 g KH2PO4; 0,05 g MgSO4.7H2O; 0,05 g CaCl2.2H2O và khi cần thiết sẽ bổ sung 0,1÷0,6 mg Fe (cho vào ở dạng FeSO4 tạo phức với EDTA).
Kĩ thuật đếm tế bào: tốc độ sinh trưởng của Nitrosomonas được đếm trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu. Một ống kính x20 làm từ khoáng chất fluorite được bố trí thêm nhằm làm tăng khả năng phóng đại hình ảnh từ 10 đến 15 lần, giúp mắt có thể nhìn trực tiếp được vi khuẩn.
Định lượng ammonia: nồng độ ammonia trong canh trường được định lượng bằng cách đem 2 ml mẫu đi chưng chất, sau đó tạo môi trường kiềm bằng cách nhỏ vài giọt NaOH 40% w/v, NH3 bay hơi ra được ngậm trong dung dịch acid boric và chuẩn độ trực tiếp bằng H2SO4 N/50.
30
Hình 32. Thiết bị fermenter dùng nuôi cấy theo mẻ và liên tục để xác định các yếu tố sinh trưởng tối ưu cho Nitrosomonas [14]
2.4.2 Kết quả thí nghiệm 2.4.2.1 Nuôi cấy trong erlen 2.4.2.1 Nuôi cấy trong erlen
Môi trường sử dụng để nuôi vi khuẩn giống với môi trường mà Engel và Alexander (1958) đề xuất, ngoại trừ việc sử dụng Na2CO3 thay vì K2CO3 cũng như không sử dụng FeNaEDTA và chất chỉ thị pH. Mỗi mẻ nuôi cấy khoảng 5 lít, nuôi trong erlen (loại 500ml, cho vào erlen 100ml môi trường), dùng máy lắc vòng, nhiệt độ 270C, thu được 19mg sinh khối khô/L và mật độ vi sinh vật là 200.106 tế bào/ml. Engel và Alexander ghi nhận kết quả đến 72,4mg sinh khối khô/L với mật độ tế bào đếm được là 190.106
tế bào/ml. Mật độ tế bào đếm được có thể thấp hơn mật độ tế bào thực tế (CFU), đây là lí do vì sao mà kết quả thu được lại khác nhau.
31
Ảnh hưởng của calcium (Ca) và magnesium (Mg)
Erlen chứa môi trường nuôi cấy (nhưng không cho CaCl2và MgSO4 vào) sẽ đem đi tiệt trùng, sau đó thêm vào từng erlen dung dịch CaCl2 và MgSO4 (đã được tiệt trùng) với hàm lượng khác nhau để kiểm tra tác động lên vi khuẩn. Cấy 1ml giống Nitrosomonas
và ủ ở 300C. Tỉ lệ sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng cách đo nồng độ NH3 ở những thời điểm khác nhau. Kết quả thu được cho thấy việc thêm 1,2 hay 5mg CaCl2.2H2O hoặc MgSO4.7H2O vào mỗi 100ml môi trường cũng không làm ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn. Nguyên nhân là do trong lượng giống cấy vào đã có 0,05mg CaCl2 và 0,05mg MgSO4 đủ đáp ứng nhu cầu về Ca và Mg của vi khuẩn trong thí nghiệm này. Kingma Boltjes (1935) thì cho rằng để vi khuẩn phát triển tối ưu thì cần gấp 6 lần lượng calci nói trên.
Ảnh hưởng của potassium phosphate (KH2PO4)
Trong 1 thí nghiệm tương tự, với các nồng độ KH2PO4 khác nhau cũng không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn N. europaea, do đó chỉ cần thêm khoảng 0,28mg KH2PO4 cho một lần cấy giống.
Ảnh hưởng của những ion kim loại khác
Sắt: việc thêm sắt với nồng độ 2 ppm không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn.
Nickel, chromium: thêm Ni (dưới dạng nickel sulphate) hoặc Cr (dưới dạng chrome alum) không gây ảnh hưởng, nhưng khi quá 0,25 ppm những kim loại này sẽ làm kiềm hãm sự sinh trưởng.
Cobalt, manganese và kẽm: việc thêm vào Co (dưới dạng nitrate), Mn (dưới dạng sulphate) hay Zn (dưới dạng sulphate) với nồng độ 1 ppm không gây ảnh hưởng đến sự phát triển.
Đồng: có khả năng ức chế vi khuẩn hoàn toàn khi nồng độ là 0,5 và 0,2; còn khi nồng độ thấp 0,1 ppm thì sẽ gây kìm hãm nhẹ hơn. Đồng được cho vào ở dạng CuSO4.
Ảnh hưởng của thép không rỉ
Người ta kiểm tra xem sự phát triển của vi khuẩn diễn ra như thế nào nếu nuôi trong fermenter làm bằng thép không rỉ. Tiến hành cho 1 mẫu thép không rỉ đã được tiệt trùng vào erlen kiểm tra, và ở erlen đối chứng thì không có. Cấy vi khuẩn
Nitrosomonas vào với mật độ ban đầu là 2,5.106 tế bào/ml, đem ủ ở 300C. Kết quả ghi nhận cho thấy trong 18 giờ đầu ở erlen đối chứng và 24 giờ đầu ở erlen kiểm tra, số lượng tế bào giảm, sau đó bắt đầu tăng theo hàm log trong 20 đến 30 giờ nuôi cấy tiếp theo rồi đạt đến pha cân bằng. Thời gian nhân đôi ở pha log là 8 giờ ở cả 2 erlen thí nghiệm, điều này cho thấy không có ảnh hưởng bởi thép không rỉ đối với sự tăng sinh của vi khuẩn.
2.4.2.2 Nuôi cấy trong fermenter
Fermenter được sử dụng trong thí nghiệm có 2 loại, loại nhỏ (đường kính 10cm, chiều cao 30cm, chứa 1,8 lít môi trường) dùng để xác định điều kiện sinh trưởng tối ưu, và loại lớn (đường kính 23cm, chiều cao 30cm, chứa 7 lít môi trường) dùng để thu sinh khối bằng
32
phương pháp lên men liên tục. Nhiệt độ được chỉnh trong khoảng 28÷320
C, cảm biến pH giữ môi trường ở trạng thái kiềm, khuấy đảo với tốc độ 600rpm.
Sự sinh trƣởng của Nitrosomonas trong nuôi cấy theo mẻ
Môi trường chứa 0,5% (NH4)2SO4 được bơm vào fermenter, chỉnh pH 7,4 bằng dung dịch Na2CO3 5%, thêm vào 100ml dịch giống. Nhiệt độ nuôi cấy giữ ở 300C. Sau vài giờ, giá trị pH giảm nhẹ, điều đó chứng tỏ sự sinh trưởng của vi khuẩn đã bắt đầu, mẫu vi sinh vật sẽ được lấy ra và định lượng tế bào. Việc nuôi cấy tiếp tục diễn ra trong 5 ngày, và mẫu sẽ được kiểm tra định kì. Kết quả cho thấy pha log diễn ra trong khoảng từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 4, mật độ tế bào đạt tối đa lên đến 520.106 tế bào/ml ở ngày thứ 5 và sau đó thì giảm nhẹ, sự sinh trưởng đi vào pha cân bằng (Hình 33).
Tác động của sắt chelate FeNaEDTA lên sự sinh trưởng của vi khuẩn
Thí nghiệm thêm sắt chelate vào môi trường ở nồng độ 0,5 ppm và pH môi trường giữ ở 7÷7,4. Kết quả cho thấy khi thêm sắt vào môi trường thì mật độ tế bào tăng từ 56.106 tế bào/ml đến 910.106 tế bào/ml trong vòng chưa đến 4 ngày, thời gian nhân đôi ở pha log là 16 giờ (Hình 33). Trong 2 thí nghiệm khác, sắt được thêm vào môi trường với nồng độ là 0,5 và 0,6 ppm, theo đó tổng số tế bào tăng từ 740.106 tế bào/ml lến 850.106 tế bào/ml. Do đó, với môi trường được đưa ra ở trên thì sắt là một nhân tố có ảnh hưởng đến sự phát triển của Nitrosomonas, đặc biệt khi nồng độ tế bào từ 500.106 tế bào/ml trở lên.
Hình 33. Tác động của sắt đến sự phát triển của Nitrosomonas trong nuôi cấy theo mẻ. (A): đường cong sinh trưởng ở mẫu đối chứng, không có sắt. (B): đường cong sinh trưởng ở mẫu
33
Sự sinh trƣởng của Nitrosomonas trong nuôi cấy liên tục
Trong thí nghiệm này, phương pháp được sử dụng là nuôi cấy vi sinh vật theo mẻ cho đến khi đạt được mật độ tế bào hoặc nồng độ NH3 mong muốn. Sau đó thêm liên tục môi trường nuôi cấy vào và xác định ảnh hưởng của các tốc độ chảy khác nhau lên mật độ tế bào và hàm lượng cơ chất (NH4)2SO4. Kết quả thu được cho thấy trong suốt giai đoạn đầu của thí nghiệm, mật độ tế bào tăng từ 11.106
tế bào/ml lên 371.106 tế bào/ml trong vòng 74 giờ (Hình 34) thời gian nhân đôi sinh khối trung bình là 16 giờ, lúc này lượng cơ chất NH3 giảm xuống mức thấp nhất. Sau đó, một dòng môi trường chảy vào fermenter với tốc độ 30ml/giờ và duy trì trong 3 ngày tiếp theo, trong suốt thời gian này, mật độ tế bào vẫn duy trì ở mức không đổi nhưng nồng độ NH3 lại tăng rất chậm mặc dù nó vẫn duy trì ở mức thấp. Sau đó, môi trường trong fermenter được pha loãng bằng cách cho vào môi trường mới để làm mật độ tế bào giảm xuống còn 125.106 tế bào/ml, tiếp tục để vi sinh vật phát triển theo mẻ cho đến khi đạt được mật độ 493.106
tế bào/ml. Sau đó lại chỉnh môi trường chảy vào liên tục với tốc độ chậm trong 3 ngày tiếp theo. Trong suốt giai đoạn nuôi cấy lần 2 cần duy trì môi trường giống với giai đoạn nuôi cấy lần 1. Trong thí nghiệm ở đây, khi cho môi trường chảy vào fermenter có dịch nuôi cấy 1,8 lít với tốc độ 30ml/ giờ thì tỉ lệ pha loãng là 0,016 thể tích/giờ và thời gian lưu trung bình của tế bào là 60 giờ ứng với tế bào đang ở giai đoạn pha log ở điều kiện nuôi cấy theo mẻ. Tuy nhiên, vì một lý do chưa xác định, tế bào thu được ở quá trình lên men liên tục lại có thời gian nhân đôi lớn hơn 16 giờ so với tế bào thu được ở quá trình lên men theo mẻ trong cùng thời gian.
Hình 34. Sự sinh trưởng của Nitrosomonas trong chế độ nuôi cấy liên tục. Đường cong phía trên là mật độ tế bào theo thời gian, đường cong phía dưới là hàm lượng (NH4)2SO4 [14]
Tác động của hàm lượng (NH4)2SO4 lên sự sinh trưởng của vi khuẩn
Trong thí nghiệm đầu tiên của loạt thí nghiệm này, môi trường nuôi cấy có chứa (NH4)2SO4 với hàm lượng 0,5 g/L. Canh trường bắt đầu được nuôi cấy theo mẻ để đạt mật độ 60.106 tế bào/ml sau đó sẽ thêm môi trường mới vào với tốc độ 30ml/giờ. Duy
34
trì chế độ này trong vài ngày, trạng thái ổn định được thiết lập trong fermenter, mật độ tế bào được duy trì ở mức 120.106 tế bào/ml và nồng độ (NH4)2SO4 khoảng 0,2g/L. Khi tăng tốc độ cấp môi trường lên 78 ml/giờ, thì một trạng thái ổn định mới được thiết lập, nồng độ (NH4)2SO4 khoảng 0,61 g/L và mật độ tế bào đạt 40.106 tế bào/ml. Kết quả này cho thấy, khi tăng lưu lượng cấp môi trường có thể đã làm rửa trôi tế bào và khi nồng độ (NH4)2SO4 tăng thì có thể làm kiềm hãm quá trình tăng sinh khối vi khuẩn.
Tác động của việc sục khí/khuấy đảo lên sự sinh trưởng của vi khuẩn
Tiến hành nuôi Nitrosomonas trong một fermenter loại lớn, ở nhiệt độ 290C, hàm lượng (NH4)2SO4 là 6 g/L, khuấy đảo ở tốc độ 1250 rpm và sục khí vào fermenter với lưu lượng 1 lít không khí/phút. Nuôi cấy theo mẻ đến khi vi khuẩn tiêu thụ hết lượng ammonia sau đó mới chuyển sang nuôi cấy liên tục. Môi trường cấp vào với tốc độ 250ml/giờ sao cho nồng độ (NH4)2SO4 duy trì ở mức dưới 0,1 g/L. Môi trường chảy tràn ra ngoài được thu lại trong một bình chứa và làm lạnh xuống dưới 100
C. Sau 5 ngày nuôi cấy thu được 30 lít canh trường vi sinh vật với mật độ 600.106 tế bào/ml, tương đương 2,14 g sinh khối khô. Mặt khác, khi dùng môi trường có hàm lượng (NH4)2SO4 là 8 g/L, với cùng chế độ nuôi cấy như trên thì canh trường vi sinh vật thu được có mật độ lên đến 800.106
tế bào/ml.
2.5Giới thiệu về Acetobacter xylinum và màng bacterial cellulose