Chủng Kr2 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng cơ bản với 10% lông trong 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300
C trong các môi trƣờng có pH khác nhau, cụ thể là pH 6, 7, 8, 9, 10 trong môi trƣờng cơ bản, tỉ lệ lông bị phân giải nhƣ sau:
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu đến khả năng sinh keratinaza
pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu Tỉ lệ lông bị phân giải (%)
6 27,5
7 34
8 33
9 28
10 18,5
Nhƣ vậy, pH tối ƣu cho nuôi cấy chủng Kr2 để cho hiệu quả sinh keratinaza phân giải lông vũ cao nhất là khoảng 7 - 8. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với một số báo cáo trƣớc đây về keratinaza mà thuộc về proteaza kiềm (10), cho rằng
keratinaza sản xuất bởi các loài vi khuẩn Bacillus hoạt động tích cực nhất trong môi trƣờng trung tính hoặc hơi kiềm. Nó cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu trên thế giới về pH tối ƣu cho sinh keratinaza của nhiều chủng vi sinh vật (5, 8, 13, 20). Nhìn chung pH tối ƣu thƣờng khoảng từ 7 - 8,5. Ở pH trên 8,5 sẽ ức chế tăng trƣởng của nhiều chủng thuộc chi Bacillus (18). Trong nghiên cứu này, pH tối ƣu cho sinh keratinaza của chủng Kr2 là khoảng 7 - 8.
3.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy ban đầu
Chủng Kr2 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng cơ bản với 10% lông trong 6 ngày, 150 vòng / phút, pH = 8 trong các môi trƣờng có nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 250C, 300C, 350C, 400C, 450C trong môi trƣờng cơ bản, dựa vào tỉ lệ lông bị phân giải cho thấy nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy tốt nhất cho khả năng sinh keratinaza chủng Kr2 là 350
C.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy nhiệt độ tối ƣu cho khả năng sinh keratinaza của các chủng có hoạt tính này rất khác nhau nhƣ: ở Bacillus subtilis
KD-N2 nhiệt độ tối ƣu là 230C (8), Bacillus pseudofirmus AL-89 là 370C (13),
Staphylococcus sp. Là 370C - 400C (20), … Đây là đặc tính sinh lý riêng của mỗi chủng.
3.5. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA KERATINAZA
3.5.1. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính keratinaza
Tiến hành thí nghiệm so sánh hoạt tính keratinaza của 6 chủng nói trên ở các pH khác nhau kết quả nhƣ sau:
Hình 3.3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính keratinaza
Kết quả ở hình 3.3 cho thấy keratinaza từ 6 chủng đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11. Ở vùng pH nhỏ hơn 7, hoạt tính keratinaza bị giảm còn dƣới 60%. Trong 6 chủng nói trên, chủng có hoạt tính keratinaza tốt nhất là Kr2 có pH tối ƣu cho hoạt động của keratinaza là 9.
Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
pH U/ml
6 26,9
7 33,9
9 44,0
10 37,4
11 34,3
Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với những mô tả về đặc tính keratinaza của nhiều nghiên cứu trên thế giới, đó là hoạt động tốt trong môi trƣờng kiềm nhƣ keratinaza từ Streptomyces albidoflavus K1-02 có hoạt tính cao nhất ở pH = 7,5 (7), keratinaza từ Bacillus licheniformis PWD-1 có hoạt tính cao nhất ở pH = 10 (10), keratinaza từ Bacillus DF1a có hoạt tính cao nhất ở pH = 8 (18),…
Tiến hành thí nghiệm so sánh hoạt tính keratinaza của 6 chủng nói trên, kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza
Kết quả ở hình 3.5 cho thấy keratinaza từ 6 chủng đều hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 30 - 600
C.
Trong 6 chủng nói trên, chủng có hoạt tính keratinaza tốt nhất là Kr2 có nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của keratinaza là 500
C.
Bảng 3.8 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Nhiệt độ (0
C) U/ml
40 44,5
50 54,3
60 48,8
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Kết quả này góp phần khẳng định keratinaza là loại enzim ƣa nhiệt giống nhƣ các nghiên cứu trƣớc đó của nhiều tác giả trên thế giới; trong đó theo Gupta và cộng sự (2006), nhiệt độ tối ƣu cho hoạt tính của các keratinazaằnm trong khoảng 300C - 800C.
3.5.3. Ảnh hƣởng của một số ion kim loại
Keratinaza thu đƣợc từ các chủng sẽ chịu ảnh hƣởng của các ion kim loại lên hoạt tính ở các mức độ khác nhau. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của một số ion kim loại lên hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2 nhƣ sau:
Bảng 9: Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Ion Hoạt độ tƣơng đối (%)
1mM 5mM
Enzim ban đầu 100 100
Na+ 110 118 Ca2+ 132,5 122 K+ 102,5 105 Mg2+ 105 104 Fe3+ 45,5 42 Cu2+ 17,5 14,5
Hoạt tính keratinaza tăng khi có mặt của một số ion nhƣ: Na+, Ca2+, K+, Mg2+, đặc biệt là ion Ca2+
, do trong cấu tạo của phân tử keratinaza có mặt của 2 ion Ca2+ ; do vậy, khi có mặt trong môi trƣờng phản ứng, ở nồng độ thấp, chúng có tác dụng hoạt hoá keratinaza (1). Một số ion nhƣ: Fe3+
, Cu2+ lại làm giảm hoạt tính của keratinaza.
KẾT LUẬN
1. Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập đƣợc 6 chủng có hoạt tính keratinaza. Các chủng này đều có khả năng sử dụng lông gà nhƣ là nguồn cacbon và nitơ duy nhất.
2. Cả 6 chủng này đều có một số đặc điểm giống chi Bacillus.
3. Keratinaza từ 6 chủng phân lập đƣợc đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11 và trong khoảng nhiệt độ 30 - 600
C.
4. Chủng Kr2 có hoạt tính keratinaza cao nhất. pH và nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của keratinaza của chủng này là pH = 9 và nhiệt độ 500
C.
5. Hoạt tính của keratinaza tăng khi trong môi trƣờng phản ứng có mặt của một số ion : Na+, Ca2+, K+, Mg2+, đặc biệt là ion Ca2+
, ở nồng độ 1 mM và 5 mM; và giảm hoạt tính khi trong môi trƣờng phản ứng có mặt một số ion nhƣ: Fe3+
, Cu2+ .
6. Điều kiện nuôi tốt nhất cho khả năng sinh keratinaza của chủng Kr2 là môi trƣờng ban đầu có hàm lƣợng lông là 20 g/l, pH = 7-8, nhiệt độ khoảng 350
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn sinh keratinaza ứng dụng vào phân huỷ lông gia cầm làm thức ăn bổ sung cho chăn nuôi và một số ứng dụng khác. 2. Ngoài các chủng sinh keratinaza tự nhiên, có thể tiếp tục nghiên cứu tạo các chủng tái tổ hợp sinh keratinaza cao hơn.
3. Nghiên cứu các thông số kĩ thuật cho lên men sinh tổng hợp keratinaza của chủng có khả năng sinh keratinaza cao nhất, tiến tới sản xuất ở quy mô công nghiệp: nhiệt độ lên men, pH môi trƣờng, mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng, thời điểm thu hồi keratinaza.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Văn Hiếu (2012), Nghiên cứu thu nhận protease kiềm tái tổ hợp có hoạt tính keratinase từ vi khuẩn và ứng dụng trong công nghiệp thuộc da, Luận án tiến
sĩ kỹ thuật, Đại học Bách khoa Hà Nội.
2. Ngô Tự Thành (2001), Sự phân bố, sinh trƣởng và sinh tổng hợp proteaza ngoại bào của Bacillus ở vùng Hà Nội, Tạp chí Sinh học, số 23 (3a), tr.153-157.
3. Võ Thị Thứ (1996), Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của một
số chủng thuộc chi Bacillus, Luận án Tiến sĩ Khoa học, Viện CNSH, Trung tâm KHTN và CNQG, Hà Nội.
Tài liệu nƣớc ngoài
4. Bertsch, A.; Coello, N; (2005). A biotechnological process for treatment and recycling poultry feathers as a feed ingredient. Biores. Technol., 96, 1703-1708.
5. Bockle, B.; Muller, R. (1997). Reduction of disulphide bonds by Streptomyces pactum during growth on chicken feathers. Appl Environ Microbiol., 63, 7990- 7992.
6. Brandelli, A. (2008). Bacterial Keratinases: Useful Enzymes for bioprocessing agroindustrial wastes and beyond. Food Bioprocess Technol., 1, 105-116.
7. Bressolier, P., Letourneau, F., Urdaci, M., & Verneuil, B. (1999). Purification and characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces
albidoflavus. Applied and Environmental Microbiology, 65, 2570–2576.
8. Cai C-G, Lou B-G, Zheng X-D (2008). Keratinase production and keratin degradation by a mutant strain of Bacillus subtilis. J. Zhejiang University, Science B. 9: 60-67.
9. Cao ZJ, Zhang Q, Wei DK, Chen L, Wang J, Zhang XQ, Zhou MH (2009). Characterization of a novel Stenotrophomonas isolate with high keratinase activity and purification of the enzyme. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36:181-188.
10. Cheng SW, Hu HM, Shen SW, Takagi H, Asano M, Tsai YC (1995). Production and characterization of a feather degrading Bacillus licheniformis
PWD-1. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2239-2243.
11. Draper, C. I., 1944. The nutritive value of corn oil meal and feather proteins.
Iowa Agr. Exp. Sta. Res. Bul. 326, Iowa State College, Ames, IA.
12. Friedrich, J.; Gradisar, H.; Mandin. D; Chaumount, J.P. (1994). Screening fungi for synthesis of keratinolytic enzymes. Lett Appl Microbiol., 28, 127-130.
13. El-Refai, H.A.; AbdelNaby, M.A.; Gaballa, A.; El-Araby, M.H.; Fatah, A.F.A. (2005). Improvement of the newly isolated Bacillus pumilus FH9 Keratinolytic activity. Process Biochem., 40, 2325-2332.
14. Geessess, A.; Kaul, R.H.; Gashe, B.A.; Mattiasson, B. (2003). Novel alkaline proteases from alkaliphilic bacteria grown on chicken feather. Enzyme and Microbial Technol., 32, 519-524.
15. Gordon, Ruth E.; William, C.; Haynes, Hor-Nay Pang, C. (1973). The Genus
Bacillus: Agriculture Handbook No. 427. ARS-USDA, Washington, D.C
16. Grazziotin, A., Pimentel, F. A., de Jong, E. V., & Brandelli, A. (2006). Nutritional improvement of feather protein by treatment with microbial keratinase.
Animal Feed Science and Technology, 126, 135–144.
17. Gupta, R., & Ramnani, P. (2006). Microbial keratinases and their prospective applications: An overview. Applied Microbiology and Biotechnology, 70,21–33
18. Guvin Govinden , Daneshwar Puchooa. (2012). Isolation and characterization of feather degrading bacteria from Mauritian soil. African Journal of Biotechnology Vol. 11(71), pp. 13591-13600.
19. Hui Ni, Qi - he Chen, Feng Chen, Ming - liang Fu, Ya - chen Dong, Hui - nong Cai (2011). Improved keratinase production for feather degradation by Bacillus
lichenifomis ZJUEL 31410 in submerged cultivation. African Journal of
20. Kim, J.M.; Lim, W.J.; Suh, H.J. (2001). Feather-degrading Bacillus species from poultry waste. Process Biochem., 37, 287-291.
21. Langeveld, J. P. M., Wang, J. J., van de Wiel, D. F. M., Shih, G. C.,Garssen, G.
J., Bossers, A., et al. (2003). Enzymatic degradation of prion protein in brain stem
from infected cattle and sheep. Journal of Infectious Diseases, 188, 1782–1789.
22. Lin, X.; Lee, C.G.; Casale, E.S.; Shih, J.C.H. (1992). Purification and characterization of a keratinase from a feather - degrading Bacillus licheniformis
strain. Appl Environ Microbiol., 58, 3271- 3275.
23. Moritz, J.S.; Latshaw, J.D. Indicators of nutritional value of hydrolyzed feather meal. Poultry Sci., 80, 79-86, 2001.
24. Mukhopadhyay, R. P., & Chandra, A. L. (1990). Keratinase of a Streptomycete. Indian. Journal of Experimental Biology, 28,575–577.
25. Noval, J. J., & Nickerson, W. J. (1959). Decomposition of native keratin by
Streptomyces fradiae. Journal of Bacteriology, 77,251–263.
26. Onifade, A.A.; Al-Sane, N.A.; Al-Musallam, A.A.; Al-Zarban, S. (1998). Potentials for biotechnological applications of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resources. Biores. Technol., 66, 1-11.
27. Papadopoulos, M.C.; El Boushy, A.R.; Roodbeen, A.E.; Ketelaars, E.H. (1986). Effects of processing time and moisture content on amino acid composition and nitrogen characteristics of feather meal. Animal Feed Sci. Technol., 14, 279- 290.
28. Parry DAT, North ACT (1998). Hard-keratin intermediate filament chains: substructure of the N and C-terminal domains and the predicted structure and function of the C-terminal domains of type and type II chains. J. Struct. Biol. 122:67-75.
29. Ramnani P., Singh R., Gupta R, 2005. Keratinolytic potential of Bacillus licheniformis RG1: structural and biochemical mechanism of feather degradation,
Can. J. Microbiol. 51, 191.
30. Rodziewicz, A.; Laba, W. (2008). Biodegradation of feather keratin by Bacillus cereus in pure culture and compost. EJPAU 11(2) #03[ISSN1505-0297].
31. Sangali, S.; Brandelli, A. (2000). Feather keratin hydrolysis by a Vibrio sp. kr2 strain. J. Appl. Microbiol., 89,735-743.
32. Sarita Agrahari , Neeraj Wadhwa (2010). Degradation of Chicken Feather a Poultry Waste Product by Keratinolytic Bacteria.
Isolated from Dumping Site at Ghazipur Poultry Processing Plant. Department of Biotechnology, 62, 482 - 492.
33. Saville, B. (1958). A scheme for colorimetric determination of microgram amount of thiols. Analyst, 83, 670-72.
34. Sidra Aftab, Samia Ahmed , Sadia Saeed , Sheikh Ajaz Rasool (2006). Screening, Isolation and Characterization of Alkaline Protease Producing Bacteria from Soil. Pakistan Journal of Biological Sciences , 9 , 2122 - 2126.
35. Suntornsuk, W.; Suntornsuk, L. (2003). Feather degradation by Bacillus sp. FK 46 in submerged cultivation. Bioresour Technol., 86, 239-243.
36. Steinert, PM, Parry, DAD (1993 ) The conserved H1 domain of the type II keratin 1 chain plays an essential role in the alignment of nearest neighbor molecules in mouse and human keratin 1/keratin 10 intermediate filaments at the two- to four-molecule level of structure. J Biol Chem. 2878–2887
37. Steinert, P. M. (1993). Structure, function, and dynamics of keratin intermediate filaments. Journal of Investigative Dermatology, 100, 729–734.
38. Takami, H.; Nogi, Y.; Horikoshi, K. (1999). Reidentification of the keratinase- producing facultatively alkaliphilic Bacillus sp no AH-101 as Bacillus halodurans. Extremophiles, 3, 293-296.
39. Takiuchi, I.; Higuchi, D.; Sei, Y.; Koga, M. (1982). Isolation of an extracellular proteinase (keratinase) from Microsporum canis. Sabouraudia, 20, 281-288. 40. Wang J.J., Shih J.C.H.(1999). Fermentation production of keratinase from Bacillus licheniformis PWD-1 and a recombinant B. subtilis FSB-29, J. Ind.
41. Wawrzkiewicz, K.; Wolski, T.; Lobarzawski, J. (1991). Screening the keratinolytic activity of dermatophytes in vitro. Mycopathologia, 114, 1-8.
42. Williams, C.M.; Lee, C.G.; Garlich, J.D.; Shih, J.C.H. (1991). Evaluation of a bacterial feather fermentation product, feather lysate, as a feed protein. Poultry Science, 70, 85-94.
43 .Wojciech Łaba, Anna Rodziewicz. (2010). Keratinolytic Potential of Feather- Degrading Bacillus polymyxa and Bacillus cereus.Polish J. of Environ. Stud. Vol. 19, No. 2 (2010), 371-378.
44. Yamamura, S., Morita, Y., Hasan, Q., Yokoyama, K., & Tamiya, E. (2002). Keratin degradation: A cooperative action of two enzymes from Stenotrophomonas
sp. Biochemical and Biophysical Research Communications, 294, 1138–1143.
45. Yu, R.J.; Harmon, S.R.; Grappel, S.F.; Blank, F. (1971). Two cell-bound keratinases of Trichophyton mentagrophytes. J. Invest. Dermatol., 55, 27-32.
PHỤ LỤC 1
Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập đƣợc 13 chủng vi khuẩn dựa trên sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc nhƣ sau:
Chủng Đặc điểm khuẩn lạc
H1 (Kr1)
Lớn, màu trắng sữa, bề mặt nhăn nheo, xù xì
H2 (Kr2)
Tròn, to, ở giữa có núm lồi lên có màu trắng ngả vàng nhạt, hơi bóng, nhớt.
H3 (Kr3)
Tròn, bờ riềm không đều, có màu vàng nhạt chuyển dần sang xám, xù xì, khô, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn và
có núm lồi ở giữa.
H4 (Kr4)
Khuẩn lạc hình tròn đều, hơi lƣợn sóng, nhẵn, thƣờng có các vòng tròn đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa chuyển sang màu kem, có khi nâu nhạt có ánh mờ đục. H5 Nhỏ, tròn, bóng, màu vàng nghệ
H6 (Kr5)
Khô, hình tròn, màu trắng, có vòng tròn màu trắng trên bề mặt, không nhăn.
H7 (Kr6)
Tròn, rất bóng và nhớt, ngả vàng
H8 Khô, hình tròn, có nhiều nếp nhăn màu trắng trên bề mặt
H9 Tròn, dạng giọt, đồng nhất, có màu trắng đục, bề mặt trơn bóng
H10 Tròn, hơi xám nâu, mƣớt, có núm lồi ở giữa. H11 Trắng sữa, nhăn, có vòng tròn, tiết chất màu nâu đen ở
xung quanh
H12 Sần sùi, nhầy, bờ riềm không đều, miệng núi lửa H13 Nhỏ, tròn, bóng, rất trong
PHỤ LỤC 2
Keratin trong bảng này đƣợc phân loại trong hai cột đầu tiên theo danh pháp đƣợc thành lập vào năm 2006 . Tên gọi khác trƣớc đây đƣợc sử dụng đƣợc liệt kê trong cột 3 và 4.
I. Keratin nhóm I
* Keratin biểu mô của người
Tên
protein Tên gen Tên khác của protein Tên khác của gen K9 KRT9 Ka9 K10 KRT10 Ka10 K12 KRT12 Ka12 K13 KRT13 Ka13 K14 KRT14 Ka14
K15 KRT15 Ka15 K16 KRT16 Ka16 K17 KRT17 Ka17 K18 KRT18 Ka18 K19 KRT19 Ka19 K20 KRT20 Ka20 K23 KRT23 Ka23 K24 KRT24 Ka24 K25 KRT25 Ka38, K25irs1, K10C, hIRSa1 KRT25A K26 KRT26 Ka39, K25irs2, K10D K27 KRT27 Ka40, K25irs3, K10B, hIRSa3.1
K28 KRT28
Ka41, K25irs4,
hIRSa2
* Keratin trong lông, tóc người
Tên protein Tên gen Tên khác của protein Tên khác của gen
K31 KRT31 Ka25, Ha1 KRTHA1
K32 KRT32 Ka26, Ha2 KRTHA2
K33a KRT33A Ka27, Ha3-I KRTHA3A K33b KRT33B Ka28, Ha3-II KRTHA3B
K34 KRT34 Ka29, Ha4 KRTHA4