Trƣớc hết, để thu dịch enzim, có thể tiến hành nhƣ sau (30):
Các chủng có hoạt tính keratinaza đƣợc nuôi lắc ở 300 C, 160 vòng / phút trong môi trƣờng chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất: Nuôi trong bình nón 500 ml có chứa 100 ml môi trƣờng cơ bản với 10% lông gà. Sau 5
ngày, dịch lọc đƣợc li tâm 10 000 vòng / phút ở 40
C trong 30 phút. Thu lấy dịch lọc (dịch enzim thô). Tủa bằng muối amoni sunphat các phân đoạn từ 0 - 80%. Kết tủa thu đƣợc sau khi bổ sung muối amoni sunphat và làm lạnh ở 40
C trong 1 giờ đƣợc thu lấy sau khi li tâm tiếp (10 000 vòng / phút ở 40C trong 30 phút). Hoà tan kết tủa vào một lƣợng tối thiểu đệm Tris - HCl (pH = 8), ta đƣợc dịch enzim có độ tinh khiết cao hơn đƣợc dùng để xác định hoạt tính keratinaza.
Hoạt tính của keratinaza đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Cheng et al. (1995) sửa đổi (10) và đƣợc thực hiện lại trong một số nghiên cứu (18,19, 43) khác nhƣ sau :
2 ml đệm Tris / HCl (pH 7,5) và 1,0 ml dịch enzim đƣợc ủ với 10 mg bột lông trong lh ở 37° C, trong một cốc nƣớc. Phản ứng enzim đƣợc dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu đƣợc ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ .
Một đơn vị (U) hoạt động của keratinase đƣợc định nghĩa là hoạt tính làm tăng độ hấp thụ lên 0,01 trong 1h ở 370
C.
2.2.5.2. Xác định ảnh hưởng của pH
Dịch enzim của các chủng có hoạt tính keratinaza đƣợc tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính enzim bằng cách: Cho 2 ml đệm ở các pH lần lƣợt 6, 7, 8, 9, 10, 11 và 1 ml dịch enzim đƣợc ủ với 10 mg bột lông trong lh ở 37° C, trong một cốc nƣớc. Phản ứng enzim đƣợc dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu đƣợc ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ.
2.2.5.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ
Dịch enzim của các chủng có hoạt tính keratinaza đƣợc tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzim bằng cách: Cho 2 ml đệm ở pH = 8 và
1,0 ml dịch enzim đƣợc ủ với 10 mg bột lông trong lh ở các nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 300
C, 400 C, 500C và 600C trong một cốc nƣớc. Phản ứng enzim đƣợc dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu đƣợc ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ.
2.2.5.4. Xác định ảnh hưởng của một số ion kim loại
Hỗn hợp gồm: 2 ml đệm Tris / HCl (pH 7,5) và 1,0 ml dịch enzim đƣợc ủ với 10 mg bột lông trong lh ở 37° C, trong một cốc nƣớc. Bổ sung vào hỗn hợp ở mỗi thí nghiệm từng loại ion: Na+
, Ca2+, K+, Mg2+, Fe3+, Cu2+ ở các nồng độ 1 mM và 5 mM. Phản ứng enzim đƣợc dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu đƣợc ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. SỰ PHÂN RÃ CỦA LÔNG GÀ KHI ĐƢỢC SỬ DỤNG LÀM NGUỒN CACBON VÀ NITƠ DUY NHẤT ĐỂ NUÔI CẤY VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH CACBON VÀ NITƠ DUY NHẤT ĐỂ NUÔI CẤY VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA
Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập đƣợc 13 chủng vi khuẩn dựa trên sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc (phụ lục 1). Các chủng sau khi đƣợc kiểm tra hoạt tính keratinaza bằng cách nuôi lắc trong môi trƣờng phân lập, tuyển chọn giống vi khuẩn có hoạt tính keratinaza nói trên ở 370C, 150 vòng / phút trong 6 ngày, chủng có hoạt tính keratinaza đã làm phân rã lông gà có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng. Trong nghiên cứu này đã phân lập đƣợc 6 chủng có hoạt tính keratinaza.
Hình 3.1. Sự phân rã của lông gà sau khi nuôi lắc 6 ngày
Những chủng này có thể sinh trƣởng, phát triển trên môi trƣờng chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất. Điều đó cho thấy 6 chủng này đều có khả năng tiết keratinaza ngoại bào để phân huỷ lông gà (mà thành phần chính của nó là keratin) làm nguồn cung cấp cacbon và nitơ cho chúng.
3.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA Sau khi nhuộm Gram, quan sát dƣới kính hiển vi, hình dạng tế bào các chủng Sau khi nhuộm Gram, quan sát dƣới kính hiển vi, hình dạng tế bào các chủng có hoạt tính keratinaza đƣợc mô tả nhƣ bảng 3.1:
Bảng 3.1: Hình thái tế bào các chủng sinh keratinaza
Chủng Hình thái tế bào
Kr 1 Gram dƣơng, tế bào hình que, tạo thành chuỗi. Kr2 Gram dƣơng, tế bào hình que tƣơng đối đồng đều, ở 2
đầu vuông, tạo thành chuỗi 2 - 4 tế bào. Kr3 Gram dƣơng, tế bào xếp thành từng đôi hay từng
chuỗi , số ít phân tán hoặc tập trung thành đám.
Kr4
Gram dƣơng, tế bào hình que ngắn, các tế bào dạng đơn hoặc xếp đôi, 2 đầu hơi tròn. Tế bào già tròn và
hơi nhẵn hơn, đôi khi có hình thoi tù 2 đầu. Kr5 Gram dƣơng, tế bào hình que ngắn, tạo thành chuỗi. Kr6 Gram dƣơng, tế bào hình que ngắn, đơn lẻ hoặc xếp
đôi, ít khi dạng chuỗi.
Tiến hành đun dịch nuôi pha loãng của chúng ở 800C trong thời gian 15 phút, để nguội rồi cấy trải trên môi trƣờng NA, ủ ở 370C trong 24h thấy đều mọc thành các khuẩn lạc; chứng tỏ đây là các chủng sinh nội bào tử.
Sau khi cấy trải mỗi chủng đã tinh sạch trên môi trƣờng NA và để trong tủ ấm (370C) 24 giờ, hình thái khuẩn lạc quan sát đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc các chủng có hoạt tính keratinaza
Chủng Đặc điểm khuẩn lạc
Kr1 Màu trắng sữa, bề mặt nhăn nheo, xù xì
Kr2 Tròn, to, ở giữa có núm lồi lên có màu trắng ngả vàng nhạt, hơi bóng, nhớt.
Kr3 Tròn, bờ riềm không đều, có màu vàng nhạt chuyển dần sang xám, xù xì, khô, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn và có núm lồi ở giữa. Kr4 Khuẩn lạc hình tròn đều, hơi lƣợn sóng, nhẵn, thƣờng có các vòng
tròn đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa chuyển sang màu kem, có khi nâu nhạt có ánh mờ đục.
Kr5 Khô, hình tròn, màu trắng, có vòng tròn màu trắng trên bề mặt, không nhăn.
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc chủng Kr2
Từ các thí nghiệm trên có thể nhận định các chủng sinh keratinaza trên đều có một số đặc điểm giống với chi Bacillus. Để phân loại chính xác hơn cần phải tiến hành thêm một số thí nghiệm kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hoá của chúng.
3.3. XÁC ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA MẠNH NHẤT NHẤT
Từ 6 chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza đã phân lập đƣợc, tiến hành mức độ hoạt động của enzim bằng 2 cách sau:
- Nuôi lắc trong môi trƣờng chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất, 150 vòng / phút ở 370C trong 10 ngày. Sau đó, so sánh tốc độ phân huỷ lông gà của các chủng sinh keratinaza theo phƣơng pháp Saville (1958). Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.3:
Bảng 3.3: Hoạt tính keratinaza của 6 chủng sinh keratinaza
Chủng Phần trăm lông gà bị phân huỷ
Kr1 58,5 Kr2 70 Kr3 60,5 Kr4 55,5 Kr5 60 Kr6 50
- Đánh giá hoạt tính keratinaza của các chủng bằng cách: Đục giếng thạch có đƣờng kính 10 mm trên các đĩa thạch có cơ chất là sữa gầy; nhỏ 0,15 ml dịch enzim thô vào các giếng thạch; giữ ở 40C trong tủ lạnh 12h rồi mang ra ngoài khoảng 15 phút sau đó đƣa vào tủ ấm 370C ủ trong 24h. Hoạt tính của keratinaza đƣợc xác định bằng đƣờng kính vòng phân huỷ trong suốt xung quanh giếng thạch, tính bằng mm. Kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.4: Hoạt tính keratinaza của dịch nuôi 6 chủng sinh keratinaza
Chủng Đƣờng kính vòng phân huỷ (cm) Kr1 1,8 Kr2 2,2 Kr3 2,0 Kr4 1,7 Kr5 1,9
Kr6 1,5
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy chủng Kr2 thể hiện hoạt tính keratinaza mạnh nhất. Chủng này đƣợc tìm thấy ở mẫu đất A.
Trong điều kiện chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất, chủng Kr2 thể hiện hoạt tính mạnh nhất; vì vậy, đây là một chủng tự nhiên có thể khai thác để nuôi cấy thu nhận keratinaza, phục vụ cho một số ứng dụng khác nhƣ đã trình bày ở phần mở đầu. Các chủng vi sinh vật sinh enzim tự nhiên là nguồn gen quý, là cơ sở dữ liệu đƣợc sử dụng để tạo các chủng tái tổ hợp đáp ứng yêu cầu sản xuất công nghiệp với khả năng sinh enzim cao (1). Do đó, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu kĩ hơn về ảnh hƣởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzim của chủng Kr2 nhằm tìm ra một số điều kiện tối ƣu hoá môi trƣờng nuôi cấy.
3.4. MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU HOÁ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY
3.4.1. Ảnh hƣởng của lƣợng lông đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy
Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất là Kr2 đƣợc nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300
C, pH = 7 trong các môi trƣờng có hàm lƣợng lông khác nhau, cụ thể là 5, 10, 15, 20, 25 g / l trong môi trƣờng cơ bản, tỉ lệ lông bị phân giải nhƣ sau:
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy
Hàm lƣợng lông (g/l) Tỉ lệ lông bị phân giải (%)
5 20,5
10 34
15 41
20 50
Nhƣ vậy, khả năng sinh keratinaza phụ thuộc vào hàm lƣợng lông đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Kết quả cho thấy, ở nồng độ lông vũ là 20 g/l cho hiệu quả phân giải cao nhất. Ở hàm lƣợng thấp hơn, hiệu quả phân giải lông vũ cũng thấp hơn. Tuy nhiên, ở hàm lƣợng cao hơn, hiệu quả phân giải cũng giảm. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Cheng et al. (1995) cho rằng hàm lƣợng lông cao làm tăng độ nhớt của môi trƣờng, có thể dẫn đến hạn chế oxy cho vi khuẩn phát triển.
3.4.2. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu
Chủng Kr2 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng cơ bản với 10% lông trong 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300
C trong các môi trƣờng có pH khác nhau, cụ thể là pH 6, 7, 8, 9, 10 trong môi trƣờng cơ bản, tỉ lệ lông bị phân giải nhƣ sau:
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu đến khả năng sinh keratinaza
pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu Tỉ lệ lông bị phân giải (%)
6 27,5
7 34
8 33
9 28
10 18,5
Nhƣ vậy, pH tối ƣu cho nuôi cấy chủng Kr2 để cho hiệu quả sinh keratinaza phân giải lông vũ cao nhất là khoảng 7 - 8. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với một số báo cáo trƣớc đây về keratinaza mà thuộc về proteaza kiềm (10), cho rằng
keratinaza sản xuất bởi các loài vi khuẩn Bacillus hoạt động tích cực nhất trong môi trƣờng trung tính hoặc hơi kiềm. Nó cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu trên thế giới về pH tối ƣu cho sinh keratinaza của nhiều chủng vi sinh vật (5, 8, 13, 20). Nhìn chung pH tối ƣu thƣờng khoảng từ 7 - 8,5. Ở pH trên 8,5 sẽ ức chế tăng trƣởng của nhiều chủng thuộc chi Bacillus (18). Trong nghiên cứu này, pH tối ƣu cho sinh keratinaza của chủng Kr2 là khoảng 7 - 8.
3.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy ban đầu
Chủng Kr2 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng cơ bản với 10% lông trong 6 ngày, 150 vòng / phút, pH = 8 trong các môi trƣờng có nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 250C, 300C, 350C, 400C, 450C trong môi trƣờng cơ bản, dựa vào tỉ lệ lông bị phân giải cho thấy nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy tốt nhất cho khả năng sinh keratinaza chủng Kr2 là 350
C.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy nhiệt độ tối ƣu cho khả năng sinh keratinaza của các chủng có hoạt tính này rất khác nhau nhƣ: ở Bacillus subtilis
KD-N2 nhiệt độ tối ƣu là 230C (8), Bacillus pseudofirmus AL-89 là 370C (13),
Staphylococcus sp. Là 370C - 400C (20), … Đây là đặc tính sinh lý riêng của mỗi chủng.
3.5. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA KERATINAZA
3.5.1. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính keratinaza
Tiến hành thí nghiệm so sánh hoạt tính keratinaza của 6 chủng nói trên ở các pH khác nhau kết quả nhƣ sau:
Hình 3.3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính keratinaza
Kết quả ở hình 3.3 cho thấy keratinaza từ 6 chủng đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11. Ở vùng pH nhỏ hơn 7, hoạt tính keratinaza bị giảm còn dƣới 60%. Trong 6 chủng nói trên, chủng có hoạt tính keratinaza tốt nhất là Kr2 có pH tối ƣu cho hoạt động của keratinaza là 9.
Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
pH U/ml
6 26,9
7 33,9
9 44,0
10 37,4
11 34,3
Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với những mô tả về đặc tính keratinaza của nhiều nghiên cứu trên thế giới, đó là hoạt động tốt trong môi trƣờng kiềm nhƣ keratinaza từ Streptomyces albidoflavus K1-02 có hoạt tính cao nhất ở pH = 7,5 (7), keratinaza từ Bacillus licheniformis PWD-1 có hoạt tính cao nhất ở pH = 10 (10), keratinaza từ Bacillus DF1a có hoạt tính cao nhất ở pH = 8 (18),…
Tiến hành thí nghiệm so sánh hoạt tính keratinaza của 6 chủng nói trên, kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza
Kết quả ở hình 3.5 cho thấy keratinaza từ 6 chủng đều hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 30 - 600
C.
Trong 6 chủng nói trên, chủng có hoạt tính keratinaza tốt nhất là Kr2 có nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của keratinaza là 500
C.
Bảng 3.8 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Nhiệt độ (0
C) U/ml
40 44,5
50 54,3
60 48,8
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Kết quả này góp phần khẳng định keratinaza là loại enzim ƣa nhiệt giống nhƣ các nghiên cứu trƣớc đó của nhiều tác giả trên thế giới; trong đó theo Gupta và cộng sự (2006), nhiệt độ tối ƣu cho hoạt tính của các keratinazaằnm trong khoảng 300C - 800C.
3.5.3. Ảnh hƣởng của một số ion kim loại
Keratinaza thu đƣợc từ các chủng sẽ chịu ảnh hƣởng của các ion kim loại lên hoạt tính ở các mức độ khác nhau. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của một số ion kim loại lên hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2 nhƣ sau:
Bảng 9: Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Ion Hoạt độ tƣơng đối (%)
1mM 5mM
Enzim ban đầu 100 100
Na+ 110 118 Ca2+ 132,5 122 K+ 102,5 105 Mg2+ 105 104 Fe3+ 45,5 42 Cu2+ 17,5 14,5
Hoạt tính keratinaza tăng khi có mặt của một số ion nhƣ: Na+, Ca2+, K+, Mg2+, đặc biệt là ion Ca2+
, do trong cấu tạo của phân tử keratinaza có mặt của 2 ion Ca2+ ; do vậy, khi có mặt trong môi trƣờng phản ứng, ở nồng độ thấp, chúng có tác dụng hoạt hoá keratinaza (1). Một số ion nhƣ: Fe3+
, Cu2+ lại làm giảm hoạt tính của keratinaza.
KẾT LUẬN
1. Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập đƣợc 6 chủng có hoạt tính keratinaza. Các chủng này đều có khả năng sử dụng lông gà nhƣ là nguồn cacbon và nitơ duy nhất.
2. Cả 6 chủng này đều có một số đặc điểm giống chi Bacillus.
3. Keratinaza từ 6 chủng phân lập đƣợc đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11 và trong khoảng nhiệt độ 30 - 600
C.
4. Chủng Kr2 có hoạt tính keratinaza cao nhất. pH và nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của keratinaza của chủng này là pH = 9 và nhiệt độ 500
C.
5. Hoạt tính của keratinaza tăng khi trong môi trƣờng phản ứng có mặt của một số