2.2.1. Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ đất
Mẫu đất đƣợc pha loãng bằng nƣớc cất vô trùng ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3,10-4, 10-5. Cấy trải trên môi trƣờng NA, ủ ở 370C trong 24h. Các khuẩn lạc mọc lên đƣợc kiểm tra, phân loại theo hình thái; sau đó đƣợc cấy ria trên môi trƣờng NA, tiếp tục ủ ở 370C trong 24h để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc. Sau khi đã đƣợc tinh sạch thì cấy truyền sang môi trƣờng LB trong ống thạch nghiêng để giữ giống.
- Pha chế môi trƣờng phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza (xem phần các loại môi trƣờng nuôi cấy). Chia đều vào các bình nón 150 ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trƣờng.
- Dùng que cấy đã vô trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy lần lƣợt một ít vi khuẩn đã tinh sạch mỗi chủng hoà vào môi trƣờng nuôi lắc trên.
Chú ý: Khử trùng que cấy sau mỗi lần lấy ở từng chủng. - Nuôi lắc, 150 vòng / phút ở 370C trong 6 ngày.
Chủng có hoạt tính keratinaza sẽ làm phân rã lông gà có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng.
2.2.2. Nghiên cứu một số đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào và khả năng sinh bào tử của các chủng sinh keratinaza. khả năng sinh bào tử của các chủng sinh keratinaza.
- Các chủng có hoạt tính keratinaza đƣợc kiểm tra hình dạng tế bào bằng cách nhuộm Gram:
+ Bƣớc 1: Làm vết bôi: Nhỏ 1 giọt nƣớc lên lam kính; dùng que cấy đã vô trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy 1 ít vi khuẩn hoà vào giọt nƣớc.
+ Bƣớc 2: Làm khô vết bôi trong không khí.
+ Bƣớc 3: Cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn: Đƣa vết bôi nhanh qua ngọn đèn cồn 2 - 3 lần.
+ Bƣớc 4: Nhuộm tiêu bản bằng dung dịch tím tinh thể (crystal violet) trong 1 phút rồi rửa lại bằng nƣớc.
+ Bƣớc 5: Nhuộm bằng dung dịch iot (dung dịch lugol) trong 1 phút rồi rửa lại bằng nƣớc.
+ Bƣớc 6: Phủ lên bằng dung dịch etanol 95% : axeton (1 : 1) trong 1 phút rồi rửa lại bằng nƣớc.
+ Bƣớc 7: Nhuộm bằng thuốc nhuộm màu đỏ trong 30 - 60s, rửa qua nƣớc, để khô.
+ Bƣớc 8: Quan sát tiêu bản ở vật kính dầu.
G+ không bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím kết tinh và iot, cồn còn làm cho các lỗ trong peptiđoglican co lại; do đó bắt màu tím.
G- bị dung môi tẩy thuốc nhuộm đầu do lipit của lớp màng ngồi bị hoà tan làm tăng tính thấm của màng; do đó, sự rửa trôi phức chất tím tinh thể - iot và làm vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc nhuộm này (đỏ). - Kiểm tra khả năng sinh nội bào tử của các chủng bằng cách:
+ Đun dịch nuôi pha loãng của mỗi chủng ở 800C trong 15 phút sau đó lấy ra để nguội.
+ Cấy trải trên môi trƣờng NA rồi đƣa vào ủ trong tủ ấm 370C trong 24h. + Lấy ra quan sát khả năng tạo khuẩn lạc của mỗi chủng.
Nếu có khả năng tạo khuẩn lạc chứng tỏ chủng nghiên cứu có khả năng sinh nội bào tử.
- Quan sát hình thái khuẩn lạc:
Lấy một ít sinh khối đã tinh sạch, pha loãng, cấy trải trên môi trƣờng NA, đƣa vào tủ ấm giữ ở 370C trong 24h rồi lấy ra quan sát.
2.2.3. So sánh khả năng sinh keratinaza của các chủng vi khuẩn
Các chủng sinh keratinaza đƣợc so sánh về khả năng sinh enzim bằng cách nuôi lắc trong môi trƣờng cơ bản chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất. Các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
Bƣớc 1: Chế tạo keratin thô từ lông gà.
- Chọn những lông gà có kích thƣớc tƣơng đối đồng đều.
- Ngâm 30 phút ở 370C trong clorofom - metanol (1:1) để loại mỡ. - Giữ trong nƣớc xà phòng 12h ở 420C.
Bƣớc 2: Pha chế môi trƣờng cơ bản kiểm tra hoạt tính enzim (xem phần các loại môi trƣờng nuôi cấy). Chia đều vào các bình nón 150 ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trƣờng cơ bản.
Bƣớc 3: Dùng pipet hút dịch chứa vi khuẩn sinh keratinaza (50 µl) thu đƣợc từ bƣớc kiểm tra hoạt tính ở trên cho vào mỗi bình nón tƣơng ứng và đánh số thứ tự. Bƣớc 4: Nuôi lắc, 150 vòng / phút trong 7 ngày.
Bƣớc 5: So sánh tốc độ phân huỷ lông gà của các chủng sinh keratinaza theo phƣơng pháp Saville (1958):
- Lông còn sót lại trong môi trƣờng nuôi cấy đƣợc thu lại bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sạch với nƣớc cất và sấy khô ở 650C đến khối lƣợng không đổi.
- Tỉ lệ phần trăm của lông bị phân huỷ đƣợc tính dựa trên khối lƣợng của lông còn lại chƣa bị phân huỷ so với khối lƣợng lông ban đầu sử dụng đƣa vào môi trƣờng.
So sánh tỉ lệ lông gà bị phân huỷ để xác định khả năng sinh keratinaza của các chủng vi khuẩn.
Để kiểm tra lại, có thể dùng phƣơng pháp đục giếng thạch, quy trình tiến hành nhƣ sau:
Sau khi đổ môi trƣờng thạch sữa gầy ra các đĩa Petri, dùng khoan thạch tạo các giếng thạch, đồng thời nhỏ 0,5 ml dịch nuôi vào các giếng thạch tƣơng ứng. Cho vào tủ lạnh giữ ở 40C từ 6 đến 8 giờ, sau đó nhấc ra đặt vào tủ nuôi cấy tại nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
Hoạt tính của keratinaza đƣợc xác định bằng đƣờng kính vòng phân huỷ trong suốt xung quanh giếng thạch, tính bằng mm.
2.2.4. Xác định một số điều kiện tối ƣu hoá môi trƣờng nuôi cấy
Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất đƣợc nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300
C trong các môi trƣờng có hàm lƣợng lông khác nhau, cụ thể là 5, 10, 15, 20, 25 g / l trong môi trƣờng cơ bản, sau đó xác định tỉ lệ lông bị phân giải để điều tra những ảnh hƣởng của nồng độ lông trên hoạt động sinh keratinaza (19).
2.2.4.2. Xác định ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu
Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất đƣợc nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300
C trong các môi trƣờng có pH khác nhau, cụ thể là pH 6, 7, 8, 9, 10 trong môi trƣờng cơ bản, sau đó xác định tỉ lệ lông bị phân giải để điều tra những ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu trên hoạt động sinh keratinaza của chủng.
2.2.4.3.Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ban đầu
Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất đƣợc nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, pH = 8 trong các môi trƣờng có nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 250
C, 300C, 350C, 400C, 450C trong môi trƣờng cơ bản, sau đó xác định tỉ lệ lông bị phân giải để điều tra những ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy ban đầu trên hoạt động sinh keratinaza của chủng đó.
2.2.5. Xác định ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và một số ion kim loại đến hoạt tính keratinaza tính keratinaza
2.2.5.1. Xác định hoạt tính keratinaza
Trƣớc hết, để thu dịch enzim, có thể tiến hành nhƣ sau (30):
Các chủng có hoạt tính keratinaza đƣợc nuôi lắc ở 300 C, 160 vòng / phút trong môi trƣờng chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất: Nuôi trong bình nón 500 ml có chứa 100 ml môi trƣờng cơ bản với 10% lông gà. Sau 5
ngày, dịch lọc đƣợc li tâm 10 000 vòng / phút ở 40
C trong 30 phút. Thu lấy dịch lọc (dịch enzim thô). Tủa bằng muối amoni sunphat các phân đoạn từ 0 - 80%. Kết tủa thu đƣợc sau khi bổ sung muối amoni sunphat và làm lạnh ở 40
C trong 1 giờ đƣợc thu lấy sau khi li tâm tiếp (10 000 vòng / phút ở 40C trong 30 phút). Hoà tan kết tủa vào một lƣợng tối thiểu đệm Tris - HCl (pH = 8), ta đƣợc dịch enzim có độ tinh khiết cao hơn đƣợc dùng để xác định hoạt tính keratinaza.
Hoạt tính của keratinaza đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Cheng et al. (1995) sửa đổi (10) và đƣợc thực hiện lại trong một số nghiên cứu (18,19, 43) khác nhƣ sau :
2 ml đệm Tris / HCl (pH 7,5) và 1,0 ml dịch enzim đƣợc ủ với 10 mg bột lông trong lh ở 37° C, trong một cốc nƣớc. Phản ứng enzim đƣợc dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu đƣợc ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ .
Một đơn vị (U) hoạt động của keratinase đƣợc định nghĩa là hoạt tính làm tăng độ hấp thụ lên 0,01 trong 1h ở 370
C.
2.2.5.2. Xác định ảnh hưởng của pH
Dịch enzim của các chủng có hoạt tính keratinaza đƣợc tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính enzim bằng cách: Cho 2 ml đệm ở các pH lần lƣợt 6, 7, 8, 9, 10, 11 và 1 ml dịch enzim đƣợc ủ với 10 mg bột lông trong lh ở 37° C, trong một cốc nƣớc. Phản ứng enzim đƣợc dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu đƣợc ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ.
2.2.5.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ
Dịch enzim của các chủng có hoạt tính keratinaza đƣợc tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzim bằng cách: Cho 2 ml đệm ở pH = 8 và
1,0 ml dịch enzim đƣợc ủ với 10 mg bột lông trong lh ở các nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 300
C, 400 C, 500C và 600C trong một cốc nƣớc. Phản ứng enzim đƣợc dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu đƣợc ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ.
2.2.5.4. Xác định ảnh hưởng của một số ion kim loại
Hỗn hợp gồm: 2 ml đệm Tris / HCl (pH 7,5) và 1,0 ml dịch enzim đƣợc ủ với 10 mg bột lông trong lh ở 37° C, trong một cốc nƣớc. Bổ sung vào hỗn hợp ở mỗi thí nghiệm từng loại ion: Na+
, Ca2+, K+, Mg2+, Fe3+, Cu2+ ở các nồng độ 1 mM và 5 mM. Phản ứng enzim đƣợc dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu đƣợc ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. SỰ PHÂN RÃ CỦA LÔNG GÀ KHI ĐƢỢC SỬ DỤNG LÀM NGUỒN CACBON VÀ NITƠ DUY NHẤT ĐỂ NUÔI CẤY VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH CACBON VÀ NITƠ DUY NHẤT ĐỂ NUÔI CẤY VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA
Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập đƣợc 13 chủng vi khuẩn dựa trên sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc (phụ lục 1). Các chủng sau khi đƣợc kiểm tra hoạt tính keratinaza bằng cách nuôi lắc trong môi trƣờng phân lập, tuyển chọn giống vi khuẩn có hoạt tính keratinaza nói trên ở 370C, 150 vòng / phút trong 6 ngày, chủng có hoạt tính keratinaza đã làm phân rã lông gà có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng. Trong nghiên cứu này đã phân lập đƣợc 6 chủng có hoạt tính keratinaza.
Hình 3.1. Sự phân rã của lông gà sau khi nuôi lắc 6 ngày
Những chủng này có thể sinh trƣởng, phát triển trên môi trƣờng chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất. Điều đó cho thấy 6 chủng này đều có khả năng tiết keratinaza ngoại bào để phân huỷ lông gà (mà thành phần chính của nó là keratin) làm nguồn cung cấp cacbon và nitơ cho chúng.
3.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA Sau khi nhuộm Gram, quan sát dƣới kính hiển vi, hình dạng tế bào các chủng Sau khi nhuộm Gram, quan sát dƣới kính hiển vi, hình dạng tế bào các chủng có hoạt tính keratinaza đƣợc mô tả nhƣ bảng 3.1:
Bảng 3.1: Hình thái tế bào các chủng sinh keratinaza
Chủng Hình thái tế bào
Kr 1 Gram dƣơng, tế bào hình que, tạo thành chuỗi. Kr2 Gram dƣơng, tế bào hình que tƣơng đối đồng đều, ở 2
đầu vuông, tạo thành chuỗi 2 - 4 tế bào. Kr3 Gram dƣơng, tế bào xếp thành từng đôi hay từng
chuỗi , số ít phân tán hoặc tập trung thành đám.
Kr4
Gram dƣơng, tế bào hình que ngắn, các tế bào dạng đơn hoặc xếp đôi, 2 đầu hơi tròn. Tế bào già tròn và
hơi nhẵn hơn, đôi khi có hình thoi tù 2 đầu. Kr5 Gram dƣơng, tế bào hình que ngắn, tạo thành chuỗi. Kr6 Gram dƣơng, tế bào hình que ngắn, đơn lẻ hoặc xếp
đôi, ít khi dạng chuỗi.
Tiến hành đun dịch nuôi pha loãng của chúng ở 800C trong thời gian 15 phút, để nguội rồi cấy trải trên môi trƣờng NA, ủ ở 370C trong 24h thấy đều mọc thành các khuẩn lạc; chứng tỏ đây là các chủng sinh nội bào tử.
Sau khi cấy trải mỗi chủng đã tinh sạch trên môi trƣờng NA và để trong tủ ấm (370C) 24 giờ, hình thái khuẩn lạc quan sát đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc các chủng có hoạt tính keratinaza
Chủng Đặc điểm khuẩn lạc
Kr1 Màu trắng sữa, bề mặt nhăn nheo, xù xì
Kr2 Tròn, to, ở giữa có núm lồi lên có màu trắng ngả vàng nhạt, hơi bóng, nhớt.
Kr3 Tròn, bờ riềm không đều, có màu vàng nhạt chuyển dần sang xám, xù xì, khô, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn và có núm lồi ở giữa. Kr4 Khuẩn lạc hình tròn đều, hơi lƣợn sóng, nhẵn, thƣờng có các vòng
tròn đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa chuyển sang màu kem, có khi nâu nhạt có ánh mờ đục.
Kr5 Khô, hình tròn, màu trắng, có vòng tròn màu trắng trên bề mặt, không nhăn.
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc chủng Kr2
Từ các thí nghiệm trên có thể nhận định các chủng sinh keratinaza trên đều có một số đặc điểm giống với chi Bacillus. Để phân loại chính xác hơn cần phải tiến hành thêm một số thí nghiệm kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hoá của chúng.
3.3. XÁC ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA MẠNH NHẤT NHẤT
Từ 6 chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza đã phân lập đƣợc, tiến hành mức độ hoạt động của enzim bằng 2 cách sau:
- Nuôi lắc trong môi trƣờng chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất, 150 vòng / phút ở 370C trong 10 ngày. Sau đó, so sánh tốc độ phân huỷ lông gà của các chủng sinh keratinaza theo phƣơng pháp Saville (1958). Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.3:
Bảng 3.3: Hoạt tính keratinaza của 6 chủng sinh keratinaza
Chủng Phần trăm lông gà bị phân huỷ
Kr1 58,5 Kr2 70 Kr3 60,5 Kr4 55,5 Kr5 60 Kr6 50
- Đánh giá hoạt tính keratinaza của các chủng bằng cách: Đục giếng thạch có đƣờng kính 10 mm trên các đĩa thạch có cơ chất là sữa gầy; nhỏ 0,15 ml dịch enzim thô vào các giếng thạch; giữ ở 40C trong tủ lạnh 12h rồi mang ra ngoài khoảng 15 phút sau đó đƣa vào tủ ấm 370C ủ trong 24h. Hoạt tính của keratinaza đƣợc xác định bằng đƣờng kính vòng phân huỷ trong suốt xung quanh giếng thạch, tính bằng mm. Kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.4: Hoạt tính keratinaza của dịch nuôi 6 chủng sinh keratinaza
Chủng Đƣờng kính vòng phân huỷ (cm) Kr1 1,8 Kr2 2,2 Kr3 2,0 Kr4 1,7 Kr5 1,9
Kr6 1,5
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy chủng Kr2 thể hiện hoạt tính keratinaza mạnh nhất. Chủng này đƣợc tìm thấy ở mẫu đất A.
Trong điều kiện chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất, chủng Kr2 thể hiện hoạt tính mạnh nhất; vì vậy, đây là một chủng tự nhiên có thể khai thác để nuôi cấy thu nhận keratinaza, phục vụ cho một số ứng dụng khác nhƣ đã trình bày ở phần mở đầu. Các chủng vi sinh vật sinh enzim tự nhiên là nguồn gen quý, là cơ sở dữ liệu đƣợc sử dụng để tạo các chủng tái tổ hợp đáp ứng yêu cầu