Cá mú cọp đực được thu mua từ các lồng nuôi thương phẩm cá mú cọp. Các con cá này được nuôi vỗ tại lồng nuôi – Vạn Ninh – Khánh Hòa. Cá bố mẹ được cho ăn bằng thức ăn cá tạp, khẩu phần thức ăn tương đương 5% khối lượng cơ thể cá bố mẹ. Những con cá mú đực trưởng thành có màu sắc tươi sáng, hoạt động tốt, không xây sát dị tật và không bị bệnh được sử dụng để tiến hành vuốt lấy tinh dịch. Trước khi tiến hành vuốt tinh, cá đực được gây mê bằng Methylene Glycol (Merck, Đức) 200 ppm. Sau đó cá đực được xác định chiều dài và khối lượng bằng thước kẻ ôli và cân. Kết quả kiểm tra chiều dài và khối lượng của cá mú cọp được thể hiện trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1: Chiều dài và khối lượng của cá mú cọp đực được đưa vào thí nghiệm
Số thứ tự cá Khối lượng (kg) Chiều dài (cm)
1 3,6 42,0 2 4,2 47,0 3 3,9 45,0 4 4,6 48,0 5 5,1 51,0 6 4,9 48,0 7 4,4 46,0 Trung bình (± SD) 4,4 ± 0,53 46,7 ± 2,81
Cách vuốt tinh: Dùng khăn sạch lau xung quanh lỗ sinh dục tránh việc lẫn tạp chất
nhằm thu được mẫu tinh trùng chất lượng tốt. Sau đó, dùng tay vuốt nhẹ bụng cá cho tinh dịch chảy vào eppendorf tube 50 mL. Khi vuốt chú ý không để nước, máu, nước tiểu và phân cá lẫn vào làm ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng. Tinh trùng được lấy vào buổi sáng và ở chỗ mát để giảm thiểu tác động trực tiếp của ánh sáng mặt trời. Mẫu tinh sau
khi thu xong được lưu giữ trên đá lạnh. Tiến hành các quan sát và phân tích ngay sau khi đưa mẫu về phòng thí nghiệm. Tinh trùng cá sẽ được phân tích hoạt lực, nếu hoạt lực lớn hơn 85% thì mới được dùng cho các quan sát và phân tích.
Hình 2.1: Vuốt tinh cá mú cọp 2.3. Xác định một số đặc tính lý học của tinh dịch
Số lượng cá thể cá đực đưa vào nghiên cứu là 7 con. Các đặc tính lý học của tinh dịch cá mú cọp cũng được phân tích trên từng cá thể. Các thông số liên quan đến đặc tính lý học được phân tích theo các hạng mục dưới đây:
Thể tích tinh dịch: Sử dụng eppendorf tube 50 ml để xác định thể tích tinh dịch.
Mật độ tinh trùng: Xác định mật độ tinh trùng bằng buồng đếm hồng cầu
Haematocymetes (MARIENFIELD, Đức) trên kính hiển vi có độ phóng đại 400X. Pha loãng tinh dịch 1000 lần trong 4% formalin (cho 1 µl tinh dịch vào trong 1000 µl nước cất có 4% formalin). Cho 10µl tinh dịch đã pha loãng lên buồng đếm hồng cầu (độ sâu 0,1 mm), chờ 3 - 5 phút cho các tinh trùng lắng xuống. Sau đó, đếm tinh trùng trong các ô đếm (4 ô đếm ở 4 góc và 1 ô ở giữa).
Mật độ tinh trùng được tính theo công thức sau:
M = A x 5 x 104 x 103
Trong đó: M: Mật độ tinh trùng trong 1mL tinh dịch (tb/mL) A: Tổng số tinh trùng đếm được trong các ô đếm
A x 5: Tổng số tinh trùng trong 25 ô vuông lớn của ô đếm 104: Nghịch đảo thể tích buồng đếm (mL)
Độ quánh của tinh dịch (spermatocrit): Tinh dịch được hút vào các ống làm bằng kính với thể tích là 75 µl. Sau đó, tiến hành ly tâm với tốc độ 15000 rpm trong thời gian 10 phút. Các ống này được lấy ra và đọc thông số trên Hawksley micro – hematocrit reader.
Hình 2.2: Xác định độ quánh tinh dịch
Số lượng tinh trùng trên một đơn vị thể tích: Được tính toán bằng thể tích của
tinh dịch với mật độ của tinh trùng.
Hoạt lực của tinh trùng: Để đánh giá hoạt lực của tinh trùng, mẫu tinh dịch được
pha loãng với nước biển nhân tạo ở tỉ lệ 1:100 (cho 1µl tinh dịch vào trong 99µl nước biển nhân tạo). Sau đó, hút 1 µl tinh dịch đã pha loãng cho lên lam kính và quan sát sự vận động của tinh trùng (phần trăm hoạt lực, vận tốc và thời gian hoạt lực) dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400X. Kính hiển vi này được kết nối với máy tính thông qua camera giúp cho việc quan sát và đánh giá được thuận lợi. Các yếu tố nói trên được phân tích bằng phần mềm CASA. Các chỉ tiêu phân tích qua CASA bao gồm:
+ Vận tốc của tinh trùng (µm/s): được tính bằng khoảng cách của chúng di chuyển trong 1 giây:
VSL (straight velocity): Vận tốc di chuyển theo đường thẳng VCL (curvilinear velocity): Vận tốc di chuyển theo đường cong
+ Phần trăm hoạt lực (%): MOT (percent motility): được xác định bằng số tinh trùng hoạt lực so với số tinh trùng quan sát được:
+ Thời gian hoạt lực (s) (longevity): được tính từ lúc pha loãng cho đến 100% tinh trùng bất hoạt.
Hình 2.3: Kiểm tra hoạt lực tinh trùng 2.4. Xác định một số đặc tính hóa học của dịch tương
Có 7 cá thể đực cá mú cọp được vuốt tinh riêng biệt và tiến hành phân tích từng con một. Xác định một số đặc tính hóa học của dịch tương được thực theo các bước như mô tả trong sơ đồ sau:
Hình 2.4: Quy trình phân tích các đặc tính hóa sinh của dịch tương cá mú cọp.
Cho tinh dịch vào các eppendorf 1,5 mL, ly tâm 15000 rpm trong 10 phút. Sau đó, phần dịch tương ở phía trên được tách ra bằng cách sử dụng micropipette hút nhẹ một cách cẩn thận để trách lẫn tạp chất từ phần tinh trùng ở phía dưới. Phần dịch tương này
Tinh dịch cá mú cọp (1,5 ml Eppendorf tube)
Ly tâm 15000 rpm (10 phút)
Thu phần dịch tương ở phía trên
pH Áp suất thẩm thấu Các ion K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Cl-,
Protein Độ mặn
được giữ lạnh 2-3 ngày rồi tiến hành phân tích các yếu tố như pH, độ mặn, áp suất thẩm thấu và các thành phần ion (K+
, Na+, Ca2+, Mg2+, Cl-, Protein). Các thành phần hóa sinh trong dịch tương được phân tích bằng máy Fuji Dri-Chem 3500 (Fujifilm Co. Ltd., Japan), áp suất thẩm thấu của dịch tương được phân tích bằng máy đo áp lực thẩm thấu (Advandced Instruments Inc., USA).
2.5. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực tinh trùng
Hoạt lực của tinh trùng được xác định sau khi pha loãng tinh trùng với nước biển nhân tạo và quan sát dưới kính hiển vi. Các thông số để đánh giá hoạt lực của tinh trùng bao gồm: vận tốc, phần trăm hoạt lực và thời gian hoạt lực của tinh trùng.
Các thí nghiệm được thực hiện theo các bước như mô tả trong sơ đồ sau:
Hình 2.5: Quy trình xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực tinh trùng cá mú cọp.
Tinh dịch cá mú cọp
Pha loãng
1:25; 1:50 1:100; 1:200
Tỷ lệ pha loãng tốt nhất cho hoạt lực của tinh trùng (1: 100)
Nhiệt độ (0
C) pH Cations: K+; Na+; Ca2+; Mg2+ Áp suất thẩm thấu
10; 20; 30; 40 6; 7; 8; 9 0; 0,2; 0,4; 0,6, 0,8M 200; 300; 400; 500 mOsm/kg
2.5.1. Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng lên hoạt lực tinh trùng
Để xác định tỷ lệ pha loãng tối ưu cho hoạt lực của tinh trùng, nước biển nhân tạo (gồm 27g NaCl; 0,5g KCl; 1,2g CaCl2; 4,6g MgCl2; 0,5g NaHCO3 trong một lít nước cất và pH 7,8) được sử dụng để pha loãng với tinh dịch với các tỷ lệ 1:25; 1:50; 1:100; 1:200 (tinh dịch : nước biển nhân tạo), sau đó kiểm tra hoạt động của tinh trùng. Mỗi tỷ lệ được lặp lại 3 lần.
Qua các lần kiểm tra cho thấy, tinh trùng cá mú cọp hoạt động tốt nhất khi pha loãng tinh dịch với nước biển nhân tạo ở tỷ lệ 1:100.
Sau khi đã xác định được tỷ lệ pha loãng tối ưu cho hoạt động của tinh trùng thì tiến hành các thử nghiệm sự ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH, các cation và áp suất thẩm thấu lên hoạt lực của tinh trùng.
2.5.2. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt lực tinh trùng
Các mẫu tinh dịch đã được pha loãng với nước biển nhân tạo ở tỉ lệ 1:100 và được điều chỉnh ở các nhiệt độ khác nhau: 10; 20; 30; 40 (oC). Mẫu được giữ trong nước có nhiệt độ ở mức cố định trong suốt thời gian quan sát bằng cách thêm đá lạnh (nếu nhiệt độ nước tăng lên) hoặc thêm nước nóng (nếu nhiệt độ nước thấp hơn). Sau mỗi 1 phút thì kiểm tra hoạt lực của tinh trùng, ghi nhận thời gian tinh trùng bắt đầu hoạt lực đến khi bất hoạt hoàn toàn. Mỗi thí nghiệm quan sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên vận động của tinh trùng được lặp lại 3 lần.
2.5.3. Xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt lực tinh trùng
Các mẫu tinh dịch đã được pha loãng với nước biển nhân tạo ở tỉ lệ 1:100 và điều chỉnh ở các mức pH khác nhau: 6; 7; 8; 9 (sử dụng NaOH 0,01N và HCl 0,01N để điều chỉnh độ pH). Sau đó, hút 1 µl tinh dịch này đưa lên lam kính và kiểm tra dưới kính hiển vi để quan sát các thông số hoạt lực tinh trùng. Ghi nhận thời gian tinh trùng bắt đầu hoạt động ở các độ pH khác nhau đến khi tinh trùng bất hoạt hoàn toàn. Mỗi thí nghiệm quan sát được lặp lại 3 lần.
2.5.4. Xác định ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng
Muối NaCl được sử dụng để pha các dung dịch có nồng độ áp suất thẩm thấu khác nhau 200; 300; 400; 500 mOsm/kg. Để kiểm tra ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đối với vận động của tinh trùng bằng cách cho tinh dịch vào các dung dịch có các mức độ áp suất
thẩm thấu khác nhau với tỷ lệ 1:100 (tinh dịch: dung dịch có áp suất thẩm thấu khác nhau). Sau đó, kiểm tra hoạt lực của tinh trùng, ghi nhận thời gian trì hoãn và thời gian hoạt lực của tinh trùng. Mỗi thí nghiệm quan sát được lặp lại 3 lần.
2.5.5. Xác định ảnh hưởng của các cation (K+
; Na+; Ca2+; Mg2+) lên hoạt lực tinh trùng
Các mẫu tinh dịch được kích hoạt trong các dung dịch chứa 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8M KCl hoặc NaCl hoặc CaCl2 hoặc MgCl2 với tỷ lệ pha loãng 1:100 (1 tinh dịch: 100 cho mỗi dung dịch muối). Sau đó, kiểm tra hoạt lực của tinh trùng, ghi nhận thời gian trì hoãn và thời gian hoạt lực của tinh trùng. Mỗi thí nghiệm quan sát được lặp lại 3 lần.
2.6. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các dữ liệu về điểm số cho hoạt lực của tinh trùng được phân tích bằng phần mềm CASA với các chỉ tiêu được phân tích: MOT (percent motility) phần trăm hoạt lực; VSL (straight velocity) vận tốc di chuyển theo đường thẳng; VCL (curvilinear velocity) vận tốc di chuyển theo đường cong; longevity: thời gian hoạt lực
Các số liệu thu thập được xử lý trên phần mềm SPSS 16.0 và Excel 2003. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, các cation và áp suất thẩm thấu lên hoạt lực của tinh trùng được so sánh theo phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (one-way ANOVA). So sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các đại lượng trên phân tích phương sai (Post Hoc Test) bằng phương pháp kiểm định Duncan’s với mức ý nghĩa P < 0,05. Mối quan hệ giữa các đại lượng được phân tích theo phương pháp hồi quy. Các giá trị được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (Mean ± SD) hoặc giá trị trung bình ± sai số chuẩn (Mean ± SE).
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc tính lý học của tinh trùng cá mú cọp
Thể tích tinh dịch của cá mú cọp dao động từ 26 - 48 mL/cá thể đực (trung bình 38,7±8,37). Mật độ tinh trùng dao động từ 29 – 38 x 109 tb/mL (trung bình 33,1±2,91 x 109). Tổng số tinh trùng là 858 – 1610 x 109 tb/cá thể đực (trung bình 1286,3 ± 323,83 x 109). Độ quánh của các mẫu tinh dịch là 88 – 95% (Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Các đặc tính lý học của tinh dịch cá mú cọp Đặc tính lý học N Thấp nhất Cao nhất GTTB ± SD Độ quánh (%) 7 88 95 92,3 ± 2,63 Thể tích (mL/cá thể) 7 26 48 38,7 ± 8,73 Mật độ (x109 tb/mL) 7 29 38 33,1 ± 2,91 Tổng số tinh trùng (x109 tb/cá thể) 7 858 1610 1286,3 ± 323,83 Kết quả phân tích trên cho thấy, thể tích tinh dịch và mật độ tinh trùng cá mú cọp
Epinephelus fuscoguttatus cao hơn so với nhiều loài cá khác đã được báo cáo bao gồm: cá bơn Scophthalmus maximus, cá hồi nâu Salmo trutta caspius, cá rô Châu Âu Perca fluviatilis, cá Brycon siebenthalae, cá hồi vân Oncorhynchus mykiss, cá đối mục Mulgi cephalus, cá bò da Thamnaconus modestus, cá đù vàng Larimichthys polyactis và cá mú đen Epinephelus malabaricus [21, 26, 32, 37, 49, 54, 55, 72]. Tuy nhiên, mật độ tinh trùng của cá mú cọp lại thấp hơn cá bơn Pseudopleuronectes yokohamae [30] và cá rô vàng Perca flavescens [28]. Bên cạnh đó, độ quánh của tinh dịch cá mú cọp thấp hơn cá đối mục Mulgi cephalus [26], cá đù vàng Larimichthys polyactis [55] và cao hơn so với cá bơn Scophthalmus maximus [72] và cá hồi biển Cynoscion nebulosus [31]. Các quan sát này khác biệt so với một số nghiên cứu khác là do một số yếu tố như độ tuổi và khối lượng của cá đực [52, 53, 78], điều kiện nuôi, dinh dưỡng, mùa vụ sinh sản, phương pháp kích thích sinh sản, tập tính sinh sản của cá đực [37, 51, 67], phương pháp và thời điểm lấy mẫu [78].
Có sự tương quan chặt chẽ giữa chiều dài và khối lượng của cá thể đực; thể tích tinh dịch và khối lượng cá đực; và đặc biệt hơn là độ quánh và mật độ tinh trùng (Bảng 3.2). Chính vì vậy, độ quánh của tinh trùng có thể được sử dụng như một thông số để đánh giá nhanh mật độ tinh trùng cá mú cọp.
Bảng 3.2: Tương quan giữa các đặc tính lý học của tinh trùng cá mú cọp (n=7) Khối lượng Chiều dài Thể tích Mật độ Độ quánh
Khối lượng - - - - - Chiều dài 0,941* - - - - Thể tích 0,657* 0,390 - - - Mật độ 0,441 0,515* 0,146 - - Độ quánh 0,324 0,532* 0,272 0,800* - Số lượng tinh trùng 0,731* 0,524* 0,933* 0,492 0,047 *Tương quan P<0,05
Kết quả tương quan giữa độ quánh tinh dịch và mật độ tinh trùng cũng được tìm thấy ở cá hồi vân Oncorhynchus mykiss [49], cá rô vàng Perca flavescens [21], cá bơn
Hippoglossus sp [78] và cá Melanogrammus aeglefinus [68]. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu trên cá bơn Scophthalmus maximus [72] cho thấy không có sự tương quan nào giữa hai thông số này. Dựa vào kết quả nghiên cứu ở nhiều loài cá khác nhau, có thể kết luận rằng độ quánh là thông số xác định mật độ tinh trùng của cá nhanh và dễ dàng.
3.2. Đặc tính hóa học của dịch tương cá mú cọp
Các đặc tính hóa học của dịch tương cá mú cọp được trình bày trong Bảng 3.3. Có thể thấy rằng Natri và Clo là hai ion chiếm ưu thế nhất trong dịch tương cá mú cọp (176,72±2,616 mmol/L Na+ và 122,45±4,815 mmol/L Cl-). Dịch tương cá mú cọp có áp suất thẩm thấu 331,14±5,640 mOsm/kg, pH = 8,09±0,195 và độ mặn 27,86±1,952 ppt.
Bảng 3.3: Các đặc tính hóa học của dịch tương cá mú cọp (n=7)
Đặc tính hóa học N Thấp nhất Cao nhất GTTB±SD Ion Na (mmol/L) 7 173,24 180,55 176,72 ± 2,616 Ion K (mmol/L) 7 5,26 9,26 7,08 ± 1,699 Ion Cl(mmol/L) 7 115,35 129,62 122,45 ± 4,815 Ion Mg (mmol/L) 7 12,28 17,32 15,07 ± 1,586 Ion Ca (mmol/L) 7 2,25 4,23 2,93 ± 0,740 Protein (g/L) 7 1,22 1,39 1,28 ± 0,067 Áp suất thẩm thấu (mOsm/kg) 7 323,00 338,00 331,14 ± 5,640
pH 7 7,80 8,30 8,09 ± 0,195 Độ mặn (ppt) 7 25,00 30,00 27,86 ± 1,952
Các thành phần vô cơ của dịch tương đã được xác định là thành phần chủ yếu ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng. Sự hiện diện hay vắng mặt của chúng sẽ ảnh hưởng đến độ pH, áp suất thẩm thấu và sự kích hoạt vận động của tinh trùng [12, 16, 17, 23, 28, 36, 38, 61, 69]. Đây cũng là một trong những thông số có thể cung cấp cho các nhà nghiên cứu tạo ra chất bảo quản nhân tạo sử dụng để bảo quản tinh trùng loài cá này.
Giống như một số loài cá xương biển khác thì thành phần dịch tương cá mú cọp bao gồm năm ion Natri, Kali, Clo, Canxi và Magie, trong đó Natri và Clo là hai ion hiện diện với nồng độ cao [48, 56]. Thêm vào đó, áp suất thẩm thấu của dịch tương lớn hơn 300 mOsm/kg, giá trị này thấp hơn nhiều so với nước biển và nó đủ thấp để ngăn chặn khả năng vận động của tinh trùng; điều này cho biết rằng hoạt lực tinh trùng cá biển phụ thuộc vào môi trường ưu trương [19, 29, 57].
Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy, có sự khác biệt giữa các thành phần có