Hình 1.1: Sơ đồ hoạt động nội tiết của cá
Trong quá trình sống sinh vật chịu sự chi phối rất lớn bởi ngoại cảnh. Các biến đổi sinh lý bên trong cơ thể cá có quan hệ chặt chẽ với sự thay đổi các yếu tố bên ngoài. Trong quá trình phát dục thành thục, sinh sản cá chịu sự chi phối và tác dụng trực tiếp hay gián tiếp của các yếu tố môi trường nước: nhiệt độ nước, dòng chảy, oxy hòa tan, những yếu tố này khi thay đổi chúng tác động lên cơ quan cảm giác như: da, thị giác, khứu giác, cơ quan đường bên, các cơ quan này sẽ truyền các xung động về trung khu thần kinh (Hypothalamus), trung khu thần kinh tổng hợp và phân tích rồi đưa ra các phản ứng tác động lên hệ nội tiết sinh sản của cá. Hoạt động nội tiết của cá được thực hiện bằng 2 hệ thần kinh là hệ peptid và adrenalin. Trung khu thần kinh tác động lên tuyến yên (Hypophysis) thông qua 2 hormone là GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone) hormone phóng thích kích dục tố và GRIF (Gonadotropin Release Inhibitory Hormone) yếu tố ức chế sự tiết kích dục tố.
Ngoại cảnh Hypothalamus
Kích dục tố: LH Kích dục tố: FSH Tuyến thượng thận Chất tạo noãn hoàng Gan Hypophysis Cơ quan nhận cảm Nang trứng Noãn bào GnRH+ GRIF- Steroid gây rụng trứng FB-
Năm 1959 (trích), Pick ford cho rằng ở cá có hai loại kích dục tố và cường độ lớn của tế bào trứng (sự tạo noãn hoàng) được điều khiển bằng một hormone giống FSH (Follicle Stimulating Hormone), trong khi phản ứng chín và rụng trứng lại liên quan với hormone giống như LH (Luteinizing Hormone). Đến nay, hàng loạt các công trình nghiên cứu đã khẳng định sự hiện diện của 2 loại kích dục tố về mặt hóa học và sinh học ở cá là rõ ràng: GTH I tương đương FSH và GTH II tương đương LH ở động vật có xương bậc cao. Giống như FSH, GTH I được tiết chủ yếu trong thời kỳ lớn lên của tuyến sinh dục (tạo noãn hoàng, tái thành thục) có chức năng kích thích sự tăng trưởng của buồng trứng và kích thích sự tạo steroid trong giai đoạn này. Giống như LH, hàm lượng GTH II tăng trong thời kỳ thành thục cuối và thay đổi hướng của quá trình tạo steroid để kích thích sự chín của các giao tử và phóng thích chúng.
Trong khi đó, Dopamin (DA) là một GRIF quan trọng, nó ức chế không những sự tiết kích dục tố cơ bản (tự phát) mà còn ức chế cả sự tiết kích dục tố dưới ảnh hưởng của GnRH (Nguyễn Tường Anh, 1999). Kal et al., (1984 trích) đã chứng minh có một nhóm tế bào thần kinh trong hốc trước thị giác tiết ra DA, từ đây DA đi vào tuyến yên và thực hiện chức năng nội tiết của mình.
Việc tiêm các chất kháng DA như pimozid hoặc reserpin tăng cường hiệu quả làm tăng kích dục tố của các loại GnRH (Sokolowka et al., 1985 a, b; Peter et al., 1985 trích Nguyễn Tường Anh, 1999). Một điều thú vị là các pimozid đơn độc có thể có tác dụng như liều sơ bộ kích dục tố, nghĩa là gây ra sự dịch chuyển của túi mầm và sự thành thục hoàn toàn của noãn bào cá (Pankhurst et al., 1985 trích). Domperidone (DOM) là một chất đối kháng mạnh của thụ thể DA, có khi gây được cả sự rụng trứng ở cá Chép (Lin et al., 1988 trích). Dưới tác dụng của các yếu tố GnRH, tuyến yên tiết ra các kích dục tố GTH I (FSH) và GTH II (LH), GTH I thúc đẩy quá trình tạo noãn hoàng, kích thích nang trứng hoạt động và sự lớn lên của noãn bào, GTH II kích thích gây chín và rụng trứng.
Quá trình tạo noãn hoàng
Sự tăng trưởng mạnh mẽ của noãn bào được gọi là quá trình tạo noãn hoàng, gồm sự tổng hợp chất noãn hoàng (Vitellogenin = Vg) trong gan kể cả sự tăng hàm lượng Vg trong huyết thanh và sự kết nạp chất này từ màu vào noãn bào (Nguyễn Tường Anh, 1999).
Trong quá trình tạo noãn hoàng ở gan và phóng thích Vg vào máu ở cá dưới sự điều khiển của hormone được xác định như sau: kích dục tố GTH I kích thích các tế bào nang trứng tiết ra Estradiol 17 (E2), đến lượt mình, E2 kích thích sự tổng hợp và tiết ra Vg bởi gan. Trước hết, E2 làm tăng số thụ thể của nó, sau đó kích thích sự tổng hợp Vg, sau khi protein này chín muồi thì được phóng thích vào máu, sau đó được kết nạp vào noãn bào sau khi có sự nhận biết thụ thể màng đặc hiệu.
Ngoài ra, E2 cũng kiểm soát các chức năng sinh lý khác của cá, E2 có hiệu ứng FB (feedback) điều hòa trục Hypothalamus - Hypophysis. Sự sản xuất các kích dục tố và GnRH được E2 kích thích.
Hormone điều khiển sự kết nạp Vg vào noãn bào
Vg trong máu được kết nạp một cách chọn lọc vào noãn bào theo phương thức vi thẩm bào (Selman & Wallace, 1982). Sự hấp thụ một cách đặc hiệu Vg cũng như sự tổng hợp chất này chịu sự kiểm soát của kích dục t ố (Nguyễn Tường Anh, 1999).
Những hormone sau đây được coi là có liên quan với sự tăng trưởng của noãn bào cá: Kích dục tố, Thyroxin, Triiodothyroxin, Insulin và hormone sinh trưởng. Tuy nhiên, vai trò của mỗi hormone này chưa được xác định đầy đủ. Mặt khác các Estrogen lại không kiểm soát sự kết nạp Vg vào noãn bào, mà ngược lại dường như còn làm giảm hoạt tính nội bào của noãn bào do tác dụng FB âm tính (FB-) của nó đối với sự tổng hợp và phóng thích kích dục tố (Holland & Dumont, 1975 trích Nguyễn Tường Anh, 1999).
Những thí nghiệm in vitro cho thấy là hoạt tính GTH I thúc đẩy sự kết nạp Vg thay đổi theo các pha của sự phát triển noãn hoàng, kích dục tố này kích thích sự kết nạp Vg ở thời gian đầu và giữa của sự phát triển noãn hoàng, đến cuối quá trình tạo noãn hoàng thì kích dục tố không có tác dụng (Nagahama et al., 1992 trích). Trong khi đó, HCG (kích dục tố màng đệm) kích thích cả sự tổng hợp Vg trong gan và hấp thụ nó bởi noãn bào (Holland & Dumont, 1975 trích trích), DOCA (Desoxycorticosteron acetat) ức chế sự hấp thụ Vg của noãn bào (Schuetz et al., 1974 trích).
Các hormone gây chín noãn bào và gây rụng trứng
Noãn bào của cá chỉ có thể chín và rụng trứng một cách hoàn toàn khi nó đã thành thục hoàn toàn (cuối giai đoạn IV), nghĩa là về mặt hình học tế bào, lúc này túi mầm đã ở sát biên, ngay dưới micropyle là đường ống mà theo đó tinh trùng xâm nhập vào trứng (Nguyễn Tường Anh, 1999).
Sự chín của noãn bào thường xảy ra trước khi rụng trứng, gồm sự tan biến của túi mầm, sự tiếp tục của giảm phân hình thành thoi giảm phân I, thể cực I được đẩy ra ngoài và rồi giảm phân lại bị phong tỏa tại metaphase II cho đến khi tinh trùng xâm nhập hay được kích thích tiếp tục bằng một tác nhân khác.
Kirshenblat (1952) đã thành công với các steroid là Methyltestosteron, Progesteron và DOCA khi hích thích cá Chạch Misgurnus fossilis rụng trứng.
Những thí nghiệm gây chín và rụng trứng các noãn bào cá in vitro trong môi trường có kích dục tố sau đó đã chứng minh chức năng nội tiết của nang trứng. Chính nang trứng mới tiết ra steroid gây chín noãn bào. Dưới tác dụng của kích dục tố GTH II nang trứng đã tạo ra và phóng thích một chất có tính chất như Progesteron, chính sản phẩm giống Progesteron này mới tác dụng lên noãn bào gây ra sự chín.
Kích dục tố chỉ gây chín cho những noãn bào còn nang trứng và không thể gây chín cho những noãn bào trần không còn nang trứng, trong khi Progesteron có thể gây chín cho cả noãn bào có nang trứng và noãn bào không nang trứng. Tuy nhiên, Progesteron chỉ có tác dụng lên bề mặt noãn bào vì Progesteron được tiêm vào noãn bào không gây ra sự chín, trong khi nếu tiếp xúc với bề mặt noãn bào thì chất này gây ra sự chín bình thường (Smith & Ecker, 1969a; Reynhout & Smith, 1974; Nagahama et al., 1994 trích). Progesteron có thể gây chín cho noãn bào trước khi noãn bào ( mà đúng hơn là nang trứng) có khả năng phản ứng với kich dục tố (Goncharov, 1969 trích). Bên cạnh đó, bề mặt noãn bào còn duy trì tính nhạy cảm với steroid khi nang trứng bắt đầu thoái hóa và mất khả năng phản ứng với kích dục tố tuyến yên. Ngoài Progesteron, 17_Hydroxy Progesteron (17P), Methytestosteron (deoxytestosteron) được hình thành ở lớp vỏ nang trứng; lớp hạt có sự hình thành 17_hydroxy_20dihydroprogesteron (17,20P) cũng là steroid tham gia gây chín trứng.
Sự rụng trứng là sự vỡ nang trứng xảy ra sau khi có sự tách của nang trứng khỏi noãn bào để cho noãn bào chín thoát ra ngoài tự do trôi nổi trong buồng trứng. Tính cả bước chuẩn bị cho sự đẩy noãn bào ra ngoài thì toàn bộ quá trình rụng trứng hết sức phức tạp. Một số quá trình dẫn đến sự rụng trứng như sự tách nang trứng khỏi noãn bào có thể được kích thích bởi các steroid gây chín. Jalabert (1978 trích) đã chứng minh các noãn bào cá Hồi mống được ấp lâu dài trong điều kiện vô trùng với 17,20P đã rụng trứng sau khi được xử lý bằng Prostagladin. Tuy là trong điều kiện ấp in vitro bình thường thì các noãn bào đã không gây được sự rụng trứngkhi tiêm cho những cá thể bị mất tuyến yên. Nhưng bản thân quá trình đẩy noãn bào ra ngoài thì chịu một sự kiểm soát khác.
Sự đẩy noãn bào ra ngoài có thể là kết quả của sự co thắt của những tế bào đặc biệt trong nang trứng. Vì sự rụng trứng được kích thích bởi kích dục tố (nội sinh và ngoại sinh) có thể bị ức chế bằng indomethacin, và vì Prostagladin có khả năng kích thích sự rụng trứng in vivo và in vitro, có vẻ như các Prostagladin là những chất trung gian tự nhiên khả dĩ của sự đẩy noãn bào ra ngoài (Nguyễn Tường Anh, 1999).
Nguyên lý cơ bản của quá trình sinh sản của cá trong điều kiện sinh sản nhân tạo
Nguyên lý cơ bản của việc kích thích sinh sản nhân tạo chính là dựa trên nguyên lý chung về sinh học sinh sản cá trong quá trình sinh sản ngoài tự nhiên. Tuy nhiên, trong điều kiện nhân tạo không thể thỏa mãn tất cả các điều kiện sinh thái như ngoài tự nhiên (nhiệt độ, oxy hòa tan, dòng chảy, …) vì thế trong sinh sản nhân tạo, chúng ta tác động vào quá trình sinh sản của cá thông qua một loạt các biện pháp kích thích sinh thái và tiêm kích dục tố, các hormone và kích dục tố sinh sản nhằm mục đích thay thế một phần hoạt động nội tiết của trung khu thần kinh (Hypothalamus) thúc đẩy hoạt động nội tiết của tuyến yên (Hypophysis) kích thích cá bố mẹ đẻ trứng và phóng tinh.Trong sinh sản nhân tạo, vai trò của các biện pháp tác động sinh lý (tiêm kích dục tố) có ý nghĩa quan trọng hơn.
Một số loại Hormone và liều lượng sử dụng trong sinh sản nhân tạo một số loài cá nhiệt đới
Catfish: Đối với loài Clarias macrocepgalus, tiêm một liều duy nhất từ 0,0026 - 0,0039 mg/cá hoặc 1,5 - 2 não thùy thể sẽ có tác dụng (Tongsanga et al., 1963; Thlathiah et al., 1986). Liều lượng HCG có hiệu quả từ 450 - 500 IU/cá (Carreon et al., 1976) hay 3000 - 4500 IU/kg trọng lượng cá (Thlathiah et al., 1988). Đối với LRHa có thể sử dụng liều lượng 10 - 30 pg/kg (Thalathiah et al., 1988; Ngamvongchon et al., 1988). Thời gian hiệu ứng kích dục tố của HCG từ 13 - 16 giờ và của LRHa từ 15 - 18 giờ.
Đối với Clarias batrachus, ở phía nam Trung Quốc chỉ sử dụng HCG với liều lượng 500 - 800 IU/kg hoặc kết hợp 500 IU/kg + 1 mg/kg Não thùy thể cũng cho hiệu quả cao (Wembiao et al., 1988). Trong khi đó, LRHa thường không sử dụng cho loài cá này.
Đối với loài Pangasius sutchi, trong sinh sản nhân tạo sử dụng cả 3 loại kích dục tố: sử dung HCG với Não thùy thể với liều lượng tiêm lần thứ nhất 300 IU/kg và tiêm lần hai 500 IU/kg kết hợp 1 - 2 Não thùy thể, khoảng cách giữa 2 lần tiêm khoảng 8 giờ (Thalathiah et al., 1988). Với liều lượng 100 IU/kg HCG + 1 Não tương ứng với thời gian hiệu ứng khoảng 24 giờ; đối với LRHa, liều lượng tiêm lần thứ nhất là 20µg/kg và tiêm lần hai là 50 µg/kg.
Chinese Carp:
Bảng 1.2: Liều l ượng HCG và Não thùy sử dụng trong sinh sản một số l oài cá Trung Quốc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hormone Tiêm lần 1 Tiêm lần 2 Hiệu ứng kích dục tố (giờ)
Aristichthys nobilis (Ngamvongchon et al., 1988)
Não thùy (não) 1 2 5 - 6
HCG (IU/kg) 200 1500 - 1800 6
Hypophthalmichthys molitrix (Ngamvongchon et al., 1988)
Não thùy (não) 1 2 6
HCG (IU/kg) 200 1500 - 1800 6
Ctenopharyngodon idella
Bảng 1.3: LRHa và liều lượng sử dụng trong sinh sản một số loài cá Trung Quốc
Hormone Tiêm lần 1 Tiêm lần 2 Hiệu ứng kích
dục tố (giờ) TLTK Aristichthys nobilis LRHa + DOM 7,5 + 1,5 67,5 + 13,5 6 - 14 (1) LRHa + HCG - 100 - 200 10 400 6 - 8 (2) Hypophthalmichthys molitrix LRHa 5 15 4 - 8 (3) LRHa + DOM 5 + 50 - 4 - 8 (2) LRHa + HCG 20- - 1500 6 - 14 (1) Ctenopharyngodon idella LRHa + DOM 10 + 15 - 8 - 12 (2)
Chú thích: Đơn vị LRHa là pg/kg, DOM (domperidone) mg/kg, HCG IU/kg; (1) (Fermin); (2) (Peter et al., 1988); (3) (Ngamvongchon et al., 1988).
Indian Major Carp: Rohu (Labeo rohita), Mrigal (Cirrhinus mrigal) and Catla (Catla catla): có thể tiêm một hay hai lần với liều lượng 7 - 14 mg/kg Não thùy, nếu tiêm 2 lần thì lần thứ nhất tiêm 1/3, lần tiêm thứ hai là 2/3. Khi sử dung HCG với liều lượng 250 IU/kg + 6 mg/kg CPE cũng cho hiệu quả khi cho sinh sản các loài cá này (Thalathiah et al., 1988).
Grouper:
Bảng 1.4: Liều lượng hormone sử dụng trong sinh sản nhân tạo một số loài cá Mú
Hormone Tiêm lần 1 Tiêm lần 2 Tiêm lần 3 Hiệu ứng kích dục tố (giờ) 1. Epinephelus akaara (Tseng and Ho, 1979)
HCG (IU/fish) 1000 500 14 - 23
2. E. fario (Kuo et al., 1988) HCG (IU/kg) 1000 1000 1000 1000 - 1000 24 - 28 24 3. E. salmoides (Kungvankij et al., 1988)
HCG (IU/fish) +CPG (µg/kg) 500 3 500 - 1000 0 - 3 0 - 500 0 - 3 12 - 15 LRHa (µg/kg) 10 10 10 12 - 15
4. E. tauvina (Chen et al., 1977) HCG (IU/kg) 500 500 - 1000 500 500 - 1000 - 0 - 500 - CPE (mg/kg) 0 - 10 0 - 15 0 - 15 -
5. E. salmonoides (Huang et al., 1986) HCG (IU/kg) + PG 1000 0 - 1 1000 1 0 - 1000 - 11 - 24
Bảng 1.5: Liều lượng hormone sử dụng trong sinh sản nhân tạo cá Chẽm mõm nhọn (Nguyễn Trọng Nho, 2003) Liều lượng (mg/kg cá) Đợt Kích dục tố Cá cái Cá đực Lần tiêm
Thời gian hiệu ứng (h) Não thùy thể cá chép 2,5 0 Lần 1 24 I LRHa Domperidone 0,235 40 0,015 20 Lần 2 11 Các đợt còn lại LRHa Domperidone 0,04 40 0, 02 20 1 34 - 36
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Cá Chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis Cuvier & Valencienes, 1828).
Thời gian nghiên cứu: Tháng 3 đến tháng 10, 2007.
Địa điểm bố trí thí nghiệm: Tại trại sản xuất giống - Nha Trang, Khánh Hòa.
Hình 2.1: Cá Chẽm mõm nhọn và DOM sử dụng trong thí nghiệm
2.2. Nuôi vỗ cá bố mẹ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cá bỗ mẹ được nuôi vỗ trong bể xi măng 4 m3, có khung lưới đảm bảo mật độ trong quá trình nuôi (hàng tháng có bắt ở mỗi nghiệm thức một số con để giải phẫu kiểm tra độ thành thục và sức sinh sản). Thí nghiệm nuôi vỗ được thực hiện với 4 nghiệm thức:
o Nghiệm thức 1: Cá không cho ăn DOM (đối chứng)
o Nghiệm thức 2: Cá cho ăn 5 mg DOM/kg trọng lượng thân o Nghiệm thức 3: Cá cho ăn 10 mg DOM/kg trọng lượng thân o Nghiệm thức 4: Cá cho ăn 15 mg DOM/kg trọng lượng thân
2.2.1. Tạo đàn cá bố mẹ Tuyển chọn cá bố mẹ
Đàn cá bố mẹ được bắt từ công ty Hoằng Ký (Đồng Bò - Nha Trang) cá được nuôi từ năm 2004 (3+ tuổi), trước khi bắt về cá được nuôi giữ trong giai đặt trong ao đất. Thức ăn nuôi vỗ là cá tạp với khẩu phần cho ăn 3 - 5 % trọng lượng thân hàng ngày. Các yếu tố môi trường trong ao nuôi thích hợp cho sự phát triển của cá. Nhiệt độ nước trong ao trung bình dao động từ 28 - 32oC, độ mặn 26 - 34 ppt, pH: 7,8 - 8,6. Mật độ nuôi 5 kg/m3 với tỷ lệ đực cái ước tính 1:1.
Cá bố mẹ được tuyển chọn dựa và ngoại hình là chính (khi tuyến sinh dục chưa phát triển): cá được chọn có ngoại hình cân đối, không bị dị tật (mắt không