dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết tim sen được phân tích theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002).
a. Nguyên tắc:
Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc tự do DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm cường độ hấp phụ của dung dịch DPPH tại bước sóng hấp thụ cực đại 517nm, màu dung dịch sẽ chuyển dần từ màu tía sang màu vàng nhạt.
b. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết tim sen
Lấy V1ml mẫu đã pha loãng 100 lần; V2ml aceton 90%. ( V1+V2=1) Lấy :1ml ethanol; 1ml DPPH 0,1mM; 1ml nước cất Lắc đều dung dịch và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút Đo độ hấp thụ ở bước sóng 517nm
Cách tiến hành:
Cho vào 5 ống nghiệm 15ml mỗi ống nghiệm với các thể tích V1 (0,1ml; 0,2ml; 0,3ml; 0,4ml; 0,5ml) dịch chiết tim sen đã được pha loãng 100 lần trong aceton 90%. Sau đó, cho vào mỗi ống nghiệm V2ml aceton 90% để mỗi ống nghiệm đủ 1ml. Tiếp theo, cho 1ml dung dịch DPPH 0,1mM pha trong ethanol, 1ml ethanol và cuối cùng cho thêm 1ml nước cất. Lắc đều rồi để phản ứng xảy ra trong bóng tối 30 phút, lắc đều trở lại rồi đưa đi đo ở bước sóng 517nm trên máy đo UV-Vis.
Mỗi thí nghiệm sẽ tiến hành lặp lại 3 lần.
Mẫu đối chứng (mẫu trắng) được tiến hành tương tự nhưng thay 1ml dịch chiết tim sen đã pha loãng bằng 1ml aceton 90%.
Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết tim sen dựa vào đường chuẩn: y = 2.4448x - 0.0058 R2 = 0.9988 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 Nồng độ DPPH (mM ) Đ ộ h ấ p t h ụ ở b ư ớ c s ó n g 5 1 7 n m Hình 2.5. Đường chuẩn DPPH
2.2.3.2. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết tim sen dựa vào tổng năng lực khử dựa vào tổng năng lực khử
Tổng năng lực khử của dịch chiết tim sen được phân tích theo phương pháp của Oyaizu (1986).
a. Nguyên tắc:
Các chất có khả năng chống oxy hóa có thể khử Fe3+ trong phân tử K3[Fe(CN]6 thành Fe2+ có khả năng tạo phức màu xanh dương với FeCl3. Đo sự thay đổi độ hấp phụ của phức tạo thành ở bước sóng 700nm có thể xác định được tổng năng lực khử của chất chống oxy hóa.
Phương trình các phản ứng xảy ra như sau:
b. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích tổng năng lực khử của dịch chiết timsen
Cách tiến hành:
Lấy V1ml mẫu dịch chiết đã pha loãng 100 lần; V2ml aceton 90%. (V1+V2 =0,5) Lấy 0,5ml K3Fe(CN)6 1% và 0,5ml đệm phosphate pH=6,6 Lắc đều, ủ ở 50oC trong 20 phút Thêm: + 0,5ml CCl3COOH 0,1% + 2ml nước cất +0,4ml FeCl3 0,1%
Lắc đều, đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 700nm
X + K3[Fe(CN)6] K4[Fe(CN)6] X + [Fe(CN)6]3+ [Fe(CN)6]4+
Cho vào 5 ống nghiệm mỗi ống với các thể tích V1 (0,1ml; 0,2ml; 0,3ml; 0,4ml; 0,5ml) dịch chiết tim sen đã được pha loãng 100 lần trong aceton 90%. Sau đó, cho vào mỗi ống nghiệm V2ml aceton 90% để thể tích mỗi ống nghiệm đủ 0,5ml. Tiếp theo, cho vào mỗi ống nghiệm 0,5ml K3[Fe(CN)6] 1% (w/v) và 0,5ml dung dịch đệm phosphate (pH=6,6; CM=0,2M), lắc đều rồi đem đi ủ ở 50oC trong 20 phút. Lấy ra, cho 0,5ml tricloacetic (CCl3COOH) 0,1% (v/v) và 2ml nước cất. Cuối cùng, cho 0,4ml FeCl3 0,1% (w/v) rồi lắc đều để yên 15 phút và đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 700nm trên máy đo UV-Vis.
Mỗi thí nghiệm sẽ tiến hành lặp lại 3 lần.
Mẫu đối chứng (mẫu trắng) được tiến hành song song bằng cách thay 0,5ml mẫu dịch chiết đã pha loãng bằng 0,5ml aceton 90%.
Xác định tổng năng lực khử của dịch chiết tim sen dựa vào độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 700nm. Hỗn hợp phản ứng có độ hấp thụ càng cao thì tổng năng lực khử càng lớn.
2.2.3.3. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết tim sen dựa vào khả năng khử hydrogen peroxide dựa vào khả năng khử hydrogen peroxide
Khả năng khử hydroperoxide của dịch chiết tim sen được phân tích theo phương pháp của Nabavi và cộng sự (2009).
a. Nguyên tắc:
Bản thân H2O2 là chất oxy hóa mạnh nên dễ hình thành gốc tự do hydroxyl gây kích hoạt cho quá trình oxy hóa. Vì vậy, có thể đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả năng khử H2O2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích khả năng khử H2O2 của dịch chiết tim sen
Cách tiến hành:
Cho vào 5 ống nghiệm mỗi ống nghiệm V1 (0,1ml; 0,2ml; 0,3ml; 0,4ml; 0,5ml) dịch chiết tim sen đã được pha loãng 100 lần trong ethanol (97%). Sau đó, cho vào mỗi ống nghiệm V2ml ethanol (97%) để thể tích mỗi ống nghiệm là 0,5ml. Tiếp theo, cho vào mỗi ống nghiệm 2,5ml H2O2 40mM và 1ml dung dịch đệm phosphate (pH=7,4; CM=50mM). Lắc đều rồi để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Sau đó, đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 230nm trên máy UV-Vis.
Mỗi thí nghiệm sẽ tiến hành lặp lại 3 lần.
Mẫu đối chứng (mẫu trắng) được tiến hành song song bằng cách thay 0,5ml mẫu dịch chiết đã pha loãng bằng 0,5ml ethanol (97%).
Kết quả được tính dựa vào công thức sau: % (H2O2) bị khử =[(Ao-A1)/Ao]*100
Trong đó: Ao: Giá trị độ hấp thụ của mẫu đối chứng ở bước sóng 230nm A1: Giá trị độ hấp thụ của thí nghiệm có mẫu dịch chiết tim sen ở bước sóng 230nm
2.2.3.4. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết tim sen dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2 dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2
a. Nguyên lý:
Lấy: + 2,5ml H2O2 40mM + 1ml dung dịch đệm
phosphate pH=7,4 Lấy V1ml mẫu dịch chiết
đã pha loãng 100 lần; V2ml ethanol.
( V1+V2=0,5)
Lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút
Lắc đều, đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 230nm
Trong hệ lipid/myoglobin/H2O2, phản ứng oxy hóa lipid bị kích hoạt bởi gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) tạo thành từ phản ứng giữa metmyoglobin (metMb) và H2O2. Sản phẩm oxy hóa lipid tạo thành phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bước sóng 535nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid nên cường độ màu đỏ son giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ son để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa.
b. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Lấy 40µl metmyoglobin 50µM Lấy 40µl H2O2100µM Lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết tim sen dựa vào mô hình phản ứng Fenton
trong hệ lipid/myoglobin/H2O2
Cách tiến hành:
Cho vào 5 ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy 40µl metmyoglobin 50µM và 40µl H2O2 100µM. Lắc đều, để phản ứng xảy ra trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó cho tiếp vào ống nghiệm 80µl EPA 50µM pha trong Twen 20, 40µl dịch chiết tim sen đã pha loãng trong aceton 90% (v/v) với hệ số pha loãng
n є {2, 4, 6, 8, 10}. Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều trên máy votex rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút. Sau đó, cho thêm vào mỗi ống nghiệm 0,3ml KCl 1,15% (w/v), 4,5ml H3PO4 1% (v/v), 1ml thiobarbituric (TBA) 0,6%. Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 95oC trong 45 phút. Sau đó, làm nguội đến nhiệt độ phòng và đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 535nm trên quang phổ kế UV-Vis.
Mỗi thí nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần.
Mẫu đối chứng (mẫu trắng) được tiến hành song song bằng cách thay 40µl mẫu dịch chiết đã pha loãng bằng 40µl dung dịch aceton 90%.
Tính kết quả:
Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(Ao – A)/Ao]*100 Ao: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng ở bước sóng 535nm
A: Độ hấp thụ của mẫu có chứa chất chống oxy hóa ở bước sóng 535nm
2.2.3.5. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết tim sen dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2
a. Nguyên lý:
Trong hệ lipid/FeCl2/H2O2, phản ứng oxy hóa lipid bị kích hoạt bởi gốc tự do (OH) tạo thành từ phản ứng giữa FeCl2 và H2O2. Sản phẩm oxy hóa lipid tạo thành phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành phức màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bước sóng 535nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid nên cường độ màu đỏ son giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ son để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương trình phản ứng Fenton:
b. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết tim sen dựa vào mô hình phản ứng Fenton
trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 Cách tiến hành: Lấy 40µl FeCl2 100µM Lấy 40µl H2O2 100µM
Lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút
Cho: + 80µl Twen 20 có chứa 50µM EPA + 40µl dịch chiết tim sen đã pha loãng.
Lắc đều, ủ ở 37oC trong 30 phút
Cho vào mỗi ống nghiệm: 0,3ml KCl3 1,15%; 4,5ml H3PO4 1%; 1ml TBARS 0,6%
Lắc đều, ủ ở 95oC trong 45 phút
Làm nguội ở nhiệt độ phòng, rồi đem đi đo độ hấp thụ ở λ=535nm
Cho vào 5 ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy 40µl FeCl2 (CM=100µM) và 40µl H2O2 (CM=100µM). Lắc đều, để phản ứng xảy ra trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, cho tiếp vào ống nghiệm 80µl Twen 20 có chứa 50µM EPA, 40µl dịch chiết tim sen đã pha loãng trong aceton 90% (v/v) với hệ số pha loãng n є {2, 4, 6, 8, 10}. Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều trên máy votex rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút. Sau đó, cho vào mỗi ống nghiệm 0,3ml KCl 1,15% (w/v), 4,5ml H3PO4 1% (v/v), 1ml thiobarbituric (TBA) 0,6%. Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 95oC trong 45 phút. Sau đó, làm nguội ở nhiệt độ phòng rồi đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 535nm trên quang phổ kế UV-Vis.
Mỗi thí nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần.
Mẫu đối chứng (mẫu trắng) được tiến hành song song bằng cách thay 40µl mẫu dịch chiết đã pha loãng bằng 40µl dung dịch aceton 90%.
Tính kết quả:
Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(Ao – A)/Ao]*100 Ao: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng ở bước sóng 535nm
A: Độ hấp thụ của mẫu có chứa chất chống oxy hóa ở bước sóng 535nm