2.1.2.1. Dụng cụ
Các dụng cụ đƣợc sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: ống nghiệm, ống đựng mẫu 15 ml, bình tam giác 250 ml, bình định mức 100 ml, 500 ml, cốc thủy tinh 500 ml, 250 ml, 100 ml, pipet 1 ml, 10 ml, phễu thủy tinh và giấy lọc, giấy nhơm.
2.1.2.2. Thiết bị
Các loại thiết bị sử dụng cho nghiên cứu này bao gồm: máy quang phổ UV-
Vis, cân phân tích điện tử SATORIUS (Nhật) chính xác 10-4 g, tủ lạnh và thiết bị cơ
quay.
2.1.2.3. Hĩa chất
Các loại hĩa chất sử dụng cho nghiên cứu này bao gồm: cồn 96o,cồn tuyệt
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Quy trình dự kiến trích ly polyphenol từ chè đen phụ phẩm.
Qua tham khảo tài liệu, chúng tơi dự kiến quy trình trích ly polyphenol từ chè đen phụ phẩm nhƣ sau:
Hình 2.2: Quy trình dự kiến trích ly polyphenol từ chè đen phụ phẩm
Giải thích quy trình:
Nguyên liệu: Nguyên liệu là chè đen phụ phẩm đƣợc thu nhận từ các nhà máy sản xuất chè túi lọc. Gồm cuộng chè và râu chè. Đƣợc bảo quản ở nơi khơ ráo.
Xử lý: Trong chè đen phụ phẩm cĩ thể cĩ một số tạp chất nhƣ cát, sạn trƣớc khi tiến hành trích ly cần loại bỏ tạp chất bằng cách sàng sau đĩ cắt nhỏ và xay. Việc loại bỏ tạp chất để tránh ảnh hƣởng đến sai số trong quá trình cân dẫn đến sai số trong quá trình định lƣợng polyphenol thu đƣợc. Sau khi loại bỏ tạp chất ta tiến hành cắt nhỏ, xay và cân chính xác khối lƣợng mỗi mẫu.
Xử lý
Trích ly polyphenol
Lọc
- Nồng độ dung mơi ?
- Tỷ lệ dung mơi/nguyên liệu ? - Nhiệt độ trích ly?
- Thời gian trích ly? - Số lần trích ly?
Sản phẩm Chè đen phụ
phẩm
Trích ly polyphenol: do điều kiện của phịng thí nghiệm tiến hành trích ly polyphenol trong mẫu bằng dung mơi. Nguyên tắc của phƣơng pháp trích ly bằng dung mơi là sự thẩm thấu dung mơi vào tế bào. Chất cần trích ly hịa tan vào dung mơi và khuếch tán ra khỏi tế bào. Quá trình trích ly kết thúc khi chất cần trích ly đạt nồng độ cân bằng trong và ngồi tế bào.
Nghiên cứu xác định các thơng số phù hợp cho quy trình: nồng độ dung mơi, tỷ lệ dung mơi/nguyên liệu, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly và số lần trích ly
thích hợp: Dung mơi: polyphenol là những hợp chất rất phân cực do đĩ rất dễ
hịa tan trong các dung mơi phân cực nhƣ cồn, ethanol, acetone, etyl acetate… Trong nghiên cứu này, qua tham khảo các tài liệu chúng tơi sử dụng dung mơi ethanol vì nĩ an tồn, cĩ giá thành thấp nhƣng lại cĩ khả năng trích ly polyphenol tốt. Thí nghiệm lựa chọn nồng độ dung mơi ethanol: 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,
của Ethanol 96o trong nƣớc và ethanol 99.5%.
Tỷ lệ dung mơi / nguyên liệu: 5/1, 10/1, 15/1, 20/1, 25/1.
Nhiệt độ trích ly: 40oC, 50oC, 60oC, 70oC.
Thời gian trích ly: 1h; 1h30; 2h; 2h30; 3h, 3h30.
Số lần trích ly: 1 lần, 2 lần, 3 lần.
Lọc: Dung dịch sau khi trích ly đem đi lọc nhằm loại bỏ các bã nguyên liệu thu đƣợc dịch trích. Ta tiến hành lọc bằng bơng và giấy lọc (phịng thí nghiệm).
Tinh chế sơ bộ: Dịch trích thu đƣợc sau quá trình lọc chứa một lƣợng lớn dung mơi. Tiến hành cơ quay để đuổi dung mơi.
2.2.2. Xác định điều kiện thích hợp để chiết polyphenol từ chè đen phụ phẩm 2.2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu chọn nồng độ dung mơi 2.2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu chọn nồng độ dung mơi
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu chọn nồng độ dung mơi
Tiến hành cân chính xác 10g chè đen cần trích ly polyphenol vào 6 bình tam giác 250ml cho vào mỗi bình tam giác 100ml ethanol 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99,50% của dung dịch Ethanol 96º trong nƣớc và bọc kín bằng giấy tráng nhơm để hạn chế sự ơxi hĩa của polyphenol. Tiến hành trích ly trong 2 giờ ở
nhiệt độ 60oC. Sau đĩ lọc để thu dịch chiết, dịch chiết thu đƣợc đƣợcđịnh lƣợng
polyphenol tổng số bằng phƣơng pháp Folin. Đánh giá hiệu xuất trích ly và chọn nồng độ dung mơi thích hợp. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 2 lần lặp.
Lọc
Chọn nồng độ dung mơi thích hợp
Định lƣợng polyphenol bằng phƣơng pháp Folin
Đánh giá hiệu xuất trích ly 80% Cân
60% 70%
50% 90% 99,5%
Trích ly bằng dung mơi Ethanol Chè đã xử lý
2.2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung mơi / nguyên liệu
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi
Tiến hành cân chính xác 10g chè đen cho vào 5 bình tam giác. Thêm lần lƣợt vào các bình tam giác dung mơi thích hợp đã chọn, trong đĩ tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi thay đổi lần lƣợt là: 5/1, 10/1, 15/1, 20/1, 25/1 (w/v). Tiến hành trích
ly trong 2 giờ ở nhiệt độ 60oC, định lƣợng và tính hiệu suất trích ly tƣơng tự nhƣ thí
nghiệm trên. Từ đĩ, chọn tỷ lệ dung mơi/nguyên liệu thích hợp. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 2 lần lặp.
25/1 Cân
5/1 15/1
Lọc
Chọ tỉ lệ dung mơi / nguyên liệu thích hợp
Định lƣợng polyphenol bằng phƣơng pháp Folin Đánh giá hiệu xuất trích ly
20/1 10/1
Trích ly với tỉ lệ dung mơi / nguyên liệu khác nhau
2.2.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ trích ly thích hợp
Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ trích ly thích hợp
Tiến hành cân chính xác 10g chè đen cho vào 6 bình tam giác. Thêm lần lƣợt vào các bình tam giác dung mơi thích hợp đã chọn với tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi thích hợp đã chọn ở trên. Tiến hành trích ly ở điều kiện nhiệt độ thay đổi trong
khoảng từ 40- 90oC ở cùng thời gian là 2 giờ. Sau đĩ ta thực hiện định lƣợng và xác
định hiệu xuất trích ly giống thí nghiệm trên. Ta chọn đƣợc nhiệt độ trích ly thích hợp. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 2 lần lặp.
Cân 40oC 60oC Lọc Chọn nhiệt độ trích ly thích hợp Định lƣợng polyphenol bằng phƣơng pháp Folin Đánh giá hiệu xuất trích ly
70oC
50oC
Trích ly với nhiệt độ khác nhau Chè đã xử lý
2.2.2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian trích ly
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian trích ly
Tiến hành cân chính xác 10g chè đen cho vào 6 bình tam giác. Tiến hành trích ly polyphenol với dung mơi và tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi thích hợp đã chọn. Thời gian trích ly thay đổi lần lƣợt là: 1h; 1h30; 2; 2h30; 3h, 3h30 ở nhiệt độ thích hợp đã chọn. Định lƣợng và tính hiệu suất trích ly cho mỗi mẫu và chọn thời gian trích ly thích hợp. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 2 lần lặp.
Cân
Lọc
Định lƣợng polyphenol bằng phƣơng pháp Folin Đánh giá hiệu xuất trích ly
Chọn thời gian trích ly thích hợp
3h
1h 1h30 2h 2h30 3h30
Trích ly với thời gian khác nhau Chè đã xử lý
2.2.2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần trích ly
Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần trích ly
Tiến hành cân chính xác khoảng 10 g chè đen vào 3 bình tam giác. Trích ly tƣơng tự các thí nghiệm trƣớc, trong đĩ sử dụng dung mơi, tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi, nhiệt độ và thời gian đã chọn; số lần trích ly thay đổi lần lƣợt là: 1; 2; 3 (lần). Tính hiệu suất trích ly polyphenol thu đƣợc sau mỗi lần trích ly. Từ đĩ, chọn số lần trích ly thích hợp. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 2 lần lặp.
3 lần Cân 2 lần Lọc Chọn số lần trích ly thích hợp Định lƣợng polyphenol bằng phƣơng pháp Folin
Đánh giá hiệu xuất trích ly 1 lần
Trích ly với số lần khác nhau Chè đã xử lý
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp định lượng polyphenol từ dịch chiết 2.3.1.1. Chiết xuất polyphenol
Cân chính xác 10g mẫu cho vào bình tam giác 250ml đƣợc bọc kín bằng giấy
bạc. Sau đĩ cho 100 ml dung mơi ethanol 70% tiến hành trích ly ở nhiệt độ 60oC
trong thời gian 2h trên máy lắc với tốc độ 250 vịng/phút. Sau khi kết thúc thời gian 2h, tiến hành lọc để thu đƣợc dịch chiết.
2.3.1.2. Pha lỗng
Tiến hành pha lỗng 300 lần. Dùng micro pipet hút 0,01 ml dịch chiết sau khi lọc ở trên cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn 3 ml ethanol 70%. Dịch pha lỗng này đƣợc dùng để xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số.
2.3.1.3. Xây dựng đường chuẩn
Đƣờng chuẩn acid galic đƣợc xây dựng trong khoảng nồng độ từ 0 đến 50% (dung dịch này chỉ sử dụng trong ngày).
2.3.1.4. Xác định hàm lượng polyphenol
Dùng micro pipet hút 1 ml dung dịch đã pha lỗng ở trên cho vào bình tam giác 100 ml. Sau đĩ cho thêm 2,5 ml thuốc thửu Folin và lắc đều trong 3 phút. Tiếp
theo cho 3 ml dung dịch Na2CO3 vào nút miệng bình và lắc đều. Tiến hành lắc ở
nhiệt độ 30oC trong thời gian 2h với tốc độ lắc là 125 vịng/phút. Sau đĩ dung dịch
đƣợc đo ở bƣớc sĩng 760 nm bằng máy đo U-Vis lấy mẫu dung mơi ethanol làm cửa đối chứng (Dùng cuvet thạch anh 10 ml).
2.3.1.5. Phương pháp tính kết quả
Hàm lƣợng polyphenol tổng số(Wtpc ) đƣợc tính theo cơng thức:
(D2-D1)*V*d
Wtpc= (mg/g)
Sstd*m
Trong đĩ:
D2: Mật độ quang thu đƣợc của dịch mẫu
Sstd: Giá trị hệ số gĩc (a)
m: Khối lƣợng mẫu phân tích (g)
V: Thể tích dịch chiết (ml)
d: Hệ số pha lỗng
2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS phiên bản 16.0 và phần mềm Excel. Phần mềm SPSS đƣợc sử dụng để phân tích sự khác biệt thống kê giữa các giá trị trung bình thu đƣợc ở mỗi thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu. Phần mềm Excel đƣợc dùng để vẽ đồ thị và biểu diễn kết quả nghiên cứu.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân tích thành phần nguyên liệu
Bảng 3.1: Kết quả xác định các chỉ tiêu hĩa học của 2 mẫu chè nguyên liệu
STT Chỉ tiêu Đơn vị tính Cuộng chè Râu chè
1 Lipit %CK 0,78 1,05
2 Protein %CK 3,8 4,5
3 Ẩm % 4,7 5,4
4 Tro %CK 3,4 2,6
5 Cacbohydrat %CK 92,22 91,85
Kết quả phân tích cho thấy hàm lƣợng cacbohydrat của cuộng chè và của râu chè đều cao. Trong khi đĩ nếu hàm lƣợng cacbohydrat trong mẫu càng cao thì nĩ sẽ cản trở polyphenol khuếch tán ra khỏi tế bào càng nhiều (Bảng 3.1). Do đĩ, trƣớc khi đƣa mẫu vào trích ly ta phải tiến hành làm nhỏ mẫu để phần nào phá vở các tế bào giúp polyphenol khuếch tán ra ngồi dễ dàng hơn.
3.2. Kết quả xác định điều kiện thích hợp để chiết polyphenol từ chè đen phụ phẩm
3.2.1. Kết quả chọn nồng độ dung mơi chiết
Kết quả thí nghiệm chọn nồng độ dung mơi chiết ảnh hƣởng đến hiệu quả trích ly polyphenol từ nguyên liệu chè đen phụ phẩm cho thấy: Khi tăng nồng độ ethanol thì hàm lƣợng polyphenol trích ly đƣợc càng tăng. Nhƣng khi tăng đến mức xác định thì hàm lƣợng polyphenol trích ly đƣợc lại giảm. Cụ thể là khi tăng nồng độ polyphenol từ 50 - 80% thì hàm lƣợng polyphenol tăng mạnh nhƣng khi tăng nồng độ ethanol từ 80 - 90% thì hàm lƣợng polyphenol tăng nhẹ. Đặc biệt, khi nồng độ ethanol tăng từ 90 - 99,5% thì hàm lƣợng polyphenol lại giảm mạnh (Hình 3.1, 3.2 và Bảng 2 - Phụ lục 2).
a b c d e e 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 50 60 70 80 90 99,5 Nồng độ (%V) H àm l ư ợ ng po ly ph eno l( m g/ g)
Hình 3.1.1: Ảnh hƣởng của nồng độ etanol (%V) đến hiệu quả trích ly polyphenol của mẫu 1 (cuộng chè)
a b c c d d 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 50 60 70 80 90 99,5 Nồng độ (%V) H àm l ư ợ ng po ly ph eno l( m g/ g)
Hình 3.1.2: Ảnh hƣởng của nồng độ etanol (%V) đến hiệu quả trích ly polyphenol của mẫu 2 (râu chè)
Kết quả này đƣợc giải thích nhƣ sau: Khi nồng độ etanol càng tăng thì polyphenol cĩ trong nguyên liệu sẽ hịa tan vào dung mơi và khuếch tán ra khỏi tế bào càng tăng làm cho hàm lƣợng polyphenol trong dịch trích ly tăng dần. Ban đầu, hàm lƣợng polyphenol trích ly đƣợc sẽ tăng nhanh nhƣng sau đĩ lại tăng chậm và giảm xuống ở nồng độ eatnol cao (99,5%) do ở nồng độ etanol thấp thì khả năng hịa tan polyphenol thấp cịn khi nồng độ etanol cao thì khả năng hịa tan polyphenol cao đặc biệt khi nồng độ ethanol rất cao thì nĩ cĩ khả năng hịa tan nhiều các chất
khác nhƣ: chất béo, nhựa, sắc tố… Các thành phần này sẽ cản trở quá trình hịa tan polyphenol vào dung mơi nên hàm lƣợng polyphenol thu đƣợc giảm. Ở nồng độ etanol 90% hàm lƣợng polyphenol trích ly đƣợc là cao nhất nhƣng khi xử lý thống kê thì ở cả hai mẫu 80% và 90% hàm lƣợng polyphenol tổng số thu đƣợc khơng cĩ sự khác biệt nên ta chọn nồng độ etanol là 80% để tiết kiệm chi phí. Do đĩ, nồng độ dung mơi 80% đƣợc chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Kết quả chọn tỷ lệ dung mơi/ nguyên liệu
Kết quả thí nghiệm chọn tỷ lệ dung mơi/ nguyên liệu ảnh hƣởng đến hiệu quả trích ly polyphenol từ nguyên liệu chè đen phụ phẩm cho thấy: Khi tăng tỷ lệ dung mơi/ nguyên liệu thì hàm lƣợng polyphenol tăng. Cụ thể, khi tăng tỷ lệ dung mơi/ nguyên liệu từ 5/1 - 25/1 thì hàm lƣợng polyphenol tăng trong đĩ tăng mạnh ở tỉ lệ 5/1 - 15/1 và tăng nhẹ ở 15/1 - 25/1 đối với mẫu cuộng chè. Cịn đối với mẫu râu chè thì hàm lƣợng polyphenol tăng từ 5/1 - 20/1, sau đĩ giảm ở 25/1 (Hình 3.2 và Bảng 3 - Phụ lục 3). a b c c c 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 5 10 15 20 25
Tỷ lệ dung mơi/ nguyên liệu
H àm l ư ợ ng po ly ph eno l (m g/ g)
a b c c c 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 5 10 15 20 25
Tỷ lệ dung mơi/ nguyên liệu
H àm l ư ợ ng po ly ph eno l (m g/ g)
Hình 3.2.2: Ảnh hƣởng của tỉ lệ dung mơi / nguyên liệu đến hiệu quả trích ly của mẫu 2
Kết quả của thí nghiệm này đƣợc giải thích nhƣ sau: Khi tỷ lệ dung mơi/ nguyên liệu tăng thì polyphenol trong chè sẽ hịa tan vào dung mơi và khuếch tán ra khỏi tế bào tăng làm cho hàm lƣợng polyphenol trong dịch trích ly tăng dần. Ban đầu, hàm lƣợng polyphenol trong chè nhiều nên sự chênh lệch nồng độ giữa bên trong và bên ngồi tế bào càng cao do đĩ sự khuếch tán polyphenol ra khỏi tế bào cũng càng nhanh và mạnh. Nhƣng dần dần hàm lƣợng polyphenol trong chè ít đi và gần bằng với hàm lƣợng polyphenol cĩ trong dịch trích ly nên sự chênh lệch nồng độ giữa bên trong và ngồi tế bào giảm làm cho khả năng khuếch tán polyphenol ra khỏi tế bào giảm. Vì thế khi càng tăng tỷ lệ dung mơi/ nguyên liệu thì hàm lƣợng polyphenol thu đƣợc tăng chậm và khơng đáng kể. Đối với mẫu 1 ở tỷ lệ dung mơi/ nguyên liệu là 15/1, đối với mẫu 2 ở tỷ lệ dung mơi/ nguyên liệu là 20/1 thì hàm lƣợng polyphenol thu đƣợc là cao nhất nhƣng khi xử lý thơng kê thì khơng cĩ sự khác biệt giữa 3 tỷ lệ là 15/1, 20/1, 25/1. Do đĩ, tỷ lệ dung mơi/ nguyên liệu 15/1 đƣợc lựa chọn để cho các thí nghiệm tiếp theo nhằm tiết kiệm dung mơi.
3.2.3. Kết quả chọn nhiệt độ trích ly