Qua tham khảo những tài liệu của các tác giả A Herfort, GT Rawlin (1999), Dennis, Kaw Gomez, Dong Joo Lim, Gun Wook Baeck, Hee Jeong Youn, Nam Shik Shin, Hwa Young Youn, Cheol Yong Hway, Jun Hong Park, Se Chang Park (2006), H.D.Nguyễn, K.Mushiake, T.Nakai, K.Muroga (1997), Yokio MAENO (2002, 2004, 2007) và phương pháp mô bệnh học vấn sử dụng tại phòng bệnh của Đại học Nha Trang, tôi đã tiến hành làm tiêu bản mô bệnh học của hai cơ quan đích của cá bị nghi ngờ cảm nhiễm virus hoại tử thần kinh là não và mắt cá. Ngoài ra để nghiên cứu ảnh hưởng của virus hoại tử thần kinh đến các tổ chức cơ quan khác của các cá này tôi cũng đã làm tiêu bản của các cơ quan khác như gan, cơ, thận, mang, lá lách, ruột, dạ dày.
- Phương pháp thu mẫu
+ Lựa chọn những ao, bể hay lồng nuôi cá biển xuất hiện các dấu hiệu giống với các bệnh lý của bệnh VNN (Viral nervuos necrosis-VNN) như đã được mô tả bởi nhiều tác giả (A Herfort, GT Rawlin (1999), Dennis, Kaw Gomez, Dong Joo Lim, Gun Wook Baeck, Hee Jeong Youn, Nam Shik Shin, Hwa Young Youn, Cheol Yong Hway, Jun Hong Park, Se Chang Park (2006), H.D.Nguyễn, K.Mushiake, T.Nakai, K.Muroga (1997), Yokio MAENO (2002, 2004, 2007), Chi SC, Phan Thị Vân, Bùi Ngọc Thanh, 2004).
Mỗi mẫu (ao hay lồng nuôi) thu gồm 10 con cá, trong đó có 7 con bộc lộ các dấu hiệu bệnh lý của bệnh hoại tử thần kinh trên cá biển và 3 con còn khỏe, không có dấu hiệu bệnh lý của bệnh này.
+ Mẫu nghiên cứu được đưa về phòng thí nghiệm phải còn sống, kèm theo các ghi chép cần thiết về những thông tin khác như địa điểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, chiều dài, dấu hiệu bệnh lý và các chỉ số môi trường chính có thể đo được khi thu mẫu: pH, nhiệt độ, độ mặn của nước ao. Trong trường hợp nơi thu mẫu ở xa, chúng tôi đã mang dụng cụ và dung dịch cố định theo để thu mẫu và cố định ngay ở nơi thu mẫu.
- Phương pháp cốđịnh mẫu
Với cá có kích thước nhỏ hơn 4 cm thì dùng xilanh để tiêm thuốc cố định vào phần đầu và nội tạng cá trước khi cắt để lấy đầu và khối nội quan tiếp tục cho vào dung dịch Bouin để cố định, tỷ lệ giữa dung dịch cố dịnh và mẫu là 1/10 về thể tích.
Với cá có kích thước lớn hơn thì giải phẫu lấy não, mắt và các nội quan cần thiết cho vào dung dịch cố định Bouin. Tỷ lệ giữa thể tích và dung dịch cố định bằng 1/10. Giữ mẫu trong dung dịch cố định từ12-36 giờ tùy kích thước mẫu trước khi thực hiện các bước tiếp theo.
- Phương pháp xử lý mẫu
Lấy mẫu ra khỏi dung dịch bảo quản. Ngâm trong cồn ethanol 95% trong 4 giờ. Sau đó ngâm trong cồn ethanol 100% trong 4 giờ. Thấm trong Parafin nóng chảy ở 68oC ít nhất trong 6 giờ.
- Phương pháp đúc Parafin và cắt lát mẫu
+ Lấy mẫu đã ngâm trong Parafin nóng chảy cho vào khuôn + Đổ Parafin nóng chảy vào khuôn mẫu
+ Cho khuôn lên giàn lạnh và để khoảng 5-10 phút
+ Dùng dao để gọt mẫu, cắt khối Parafin có mẫu thành một khối hình thang cân hoặc hình chữ nhật
+ Gắn khuôn gỗ chứa mẫu vào máy Microton + Cắt lát có độ dày từ 5-7 µm
+ Đưa lát cắt vào nước ấm (40-50oC) khoảng 1-2 phút để lát cắt giãn không bị nhăn, nước ấm có bổ sung albumin có trong lòng trắng trứng gà..
+ Dùng lam sạch để lấy lát cắt ra khỏi nước + Đặt lên máy sấy slide ở 45-60oC trong 1-4 giờ
- Phương pháp nhuộm Hematoxyline-Mayer và Eosin
+ Làm mất Parafin trong Xylen Xylen 1: 5 phút Xylen 2: 5 phút + Làm no nước mẫu Ethanol 100%: 2-3 phút Ethanol 100%: 2-3 phút Ethanol 95%: 2-3 phút Ethanol 95%: 2-3 phút Ethanol 80%: 2-3 phút Ethanol 80%: 2-3 phút Ethanol 50%: 2-3 phút
+ Rửa nước: nhúng trong nước 3-6 lần + Nhuộm Haematoxyline 4-6 phút + Rửa qua nước chảy nhẹ trong 4-6 phút + Nhuộm Eosin trong 2-3 phút
+ Làm mất nước mẫu
Nhúng trong Ethanol 90%: 10 lần Nhúng trong Ethanol 90%: 10 lần Nhúng trong Ethanol 100%: 10 lần Nhúng trong Ethanol 100%: 10 lần + Làm trong mẫu trong Xylen
Xylen lần 1: 2-3 phút Xylen lần 2: 2-3 phút
- Phương pháp đọc tiêu bản mô bệnh học để phát hiện sự cảm nhiễm của virus gây hoại tử thần kinh
Dựa trên những kết quả nghiên cứu về bệnh hoại tử thần kinh (VNN) trên các đối tượng cá biển của nhiều tác giả như A Herfort, GT Rawlin (1999), Gilda D. Lio-Po and Leobert D. dela Pena, H.D.Nguyễn, K.Mushiake, T.Nakai, K.Muroga (1997), Yokio MAENO, Leobert D. DE LA PENA and Erlinda R.CRUZ-LACIERDA (2002, 2004)…tôi đã tiến hành quan sát sự biến đổi trong tổ chức mô và tế bào ở 2 cơ quan đích của virus VNN là mô mắt và não bằng kính hiển vi, để phát hiện sự tồn tại của các khoảng rỗng dạng không bào hình tròn hay hình elíp trong mô của 2 tổ chức cơ quan nói trên. Sự biến đổi mô bệnh học này được so sánh với đặc điểm mô học của 2 cơ quan này trên cơ thể các con cá khỏe mạnh, không thấy xuất hiện không bào hình tròn hoặc elip.