4.2.1. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của A. baumannii theo MIC
Nồng độ ức chế tối thiểu của các kháng sinh thử nghiệm trên 81 chủng A. baumannii phân lập được cho thấy mức độ kháng thuốc đo được cũng đáng báo động nhất là với nhóm cephalosporin có MIC từ 2 – 32 µg/ml, tương ứng với mức độ kháng với ceftazidin lên tới 75% mức nhạy cảm chỉ còn 25%, với cefepim có mức độ kháng và trung gian cao (35% và 23,8%), nhạy chỉ còn 41,2%. Với nhóm fluoquinolon với ciprofloxacin có MIC từ 0,25 – 2,5 µg/ml tương ứng với mức độ kháng khá cao 60% và nhạy cảm cũng chỉ còn 40%. Với nhóm Aminoglucoside cho kháng sinh amikacin với MIC đo được từ 4 - ≥ 64 µg/ml, tương ứng với mức độ kháng 48,8% và nhạy 51,2%. Đặc biệt ở nhóm kháng sinh đặc trị cho A. baumannii
carbapenem chúng tôi đo được MIC từ 0,25 – ≥16 µg/ml, tương ứng với mức độ kháng của imipenem (56,2%) và meronem (51,2%) và mức độ nhạy chỉ còn 43,8% và 47,8%. Riêng với kháng sinh colistin, MIC đo được còn rất thấp từ 0,5 – 1 µg/ml và còn nhạy 100%.
Mặc dù vậy, nghiên cứu của chúng tôi có MIC của các kháng sinh với các chủng A. baumannii phân lập được còn thấp hơn so với nghiên cứu của Văn Đình
Tráng và CS., thực hiện năm 2011, thực hiện trên tất cả các loại bệnh phẩm nhiễm
A. baumannii tại BV Nhiệt đới Trung ương Hà nội cho thấy MIC của hầu hết các KS đều rất cao như của ceftazidin và cefepim đo được cao hơn (1 – 64 µg/ml) và mức độ kháng với ceftazidin và cefepim là rất cao (98,6% và 97,2%); MIC của ciprofloxacin 0,25 – 4 µg/ml, tương ứng kháng 97,2%. Đặc biệt MIC của nhóm carbapenem tương tự như của chúng tôi nhưng mức độ kháng khá cao lên tới 91,5 cho cả hai kháng sinh imipenem và meronem và với colistin MIC có dải khá rộng 0,5 – 16 µg/ml, và còn nhạy 100% và có một sự khác biệt là MIC của amikacin 2 - 64 µg/ml và mức độ kháng rất thấp 18,3% [17].
Có thể là do nghiên cứu của chúng tôi làm trên quy mô nhiều bệnh viện và 3 vùng miền khác nhau và chỉ làm trên bệnh phẩm máu của BN được chẩn đoán là NKH, còn của Văn Đình Tráng và CS., là một nghiên cứu của tuyến cuối cùng, nơi tập trung tất cả các bệnh nặng, và việc sử dụng kháng sinh để điều trị là tất yếu và nghiên cứu cũng lấy mẫu trên nhiều bệnh phẩm khác nhau do vậy có tỷ lệ kháng rất cao và nhạy cảm còn rất thấp và điều này cũng cho thấy, cần thiết phải có giám sát vi khuẩn này ở mức độ nhiều bệnh viện, vùng để có một hướng dẫn lựa chọn điều trị thích hợp và hiệu quả.
Nghiên cứu của chúng tôi khi so sánh với các tác giả khác ở khu vực châu Á với MIC của A. baumannii trong máu cho thấy MIC của chúng tôi thấp hơn các tác giả khác như Niumsup và CS. (2009), tại Thái Lan MIC của imipenem và meronem là từ 4 - 128 µg/ml. NC của Pongpech, Thái lan (2010), MIC của IPM 8-128 μg/ml với MIC 50 (32 µg/ml) và MIC 90 (64 µg/ml) và MEM 64-256 μg/ml với MIC 50 và MIC 90 như nhạy (128 µg/ml) [111], [118]. Tại châu Âu MIC cũng cao hơn như của Giannouli và CS. (2010), thực hiện tại Ý, cho thấy, MIC của imipenem (8 – 32 µg/ml) và meronem (4 – 16 µg/ml); ceftazidin (125 – 250 µg/ml); cefepim (16 – 250 µg/ml); amikacin (125 -250 µg/ml); ciprofloxacin (32 – 250 µg/ml). NC của Senkyrikova (2013), tại Cộng Hòa Czech với imipenem (16 - >32 µg/ml), meronem (12 - >32 µg/ml) [62], [126], nghiên cứu của Lai và CS. (2012), thực hiện tại Đài
loan cho thấy, MIC với imipenem (0,25 – 16 µg/ml), tương ứng với kháng 71%, với meronem (0,25 – 32 µg/ml), tương ứng kháng 76%, với cefepim (1 – 128 µg/ml), tương ứng với kháng 47% và với colistin cũng còn nhạy 100% [84]. Như vậy nồng độ MIC của colistin cho A. baumannii ở Việt nam còn thấp, tuy nhiên với khuynh hướng sử dụng ngày càng gia tăng ở hầu hết các bệnh viện và là kháng sinh được coi như là thuốc lựa chọn thay thế sau cùng để điều trị A. baumannii đa kháng mà không có những chính sách, khuyến cáo và phác đồ cụ thể mang tầm quốc gia vùng, sẽ dẫn tới nhanh chóng kháng KS và chúng ta sẽ không còn thuốc nào dành cho điều trị vi khuẩn này.
Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu của nhiều tác giả khác nhau về tính kháng thuốc của A. baumannii trên thế giới. Nhưng ở Việt Nam đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên về MIC được thực hiện trên nhiều bệnh viện ở cả ba miền Bắc, Trung và Nam, đặc biệt là chỉ thực hiện trên đối tượng bệnh nhân NKH do A. baumannii nằm ở tất cả các khoa phòng và mọi đối tượng bệnh nhân (người lớn và trẻ em). Nghiên cứu cũng cho thấy sự kháng kháng sinh của A. baumannii nói riêng và các VK khác nói chung, thay đổi theo địa phương, theo không gian và theo thời gian. Song không vì thế mà chúng ta không nghiên cứu về chúng.
Việc nghiên cứu về tính kháng thuốc, nồng độ ức chế tối thiểu của từng loại kháng sinh đặc trị cho A. baumannii trong NKH là một sự cần thiết. Nó giúp cho các nhà lâm sàng có một quyết định tốt nhất trong chọn lựa KS điều trị theo kinh nghiệm khi chưa có kết quả cấy máu, cũng như khi chưa có kết quả kháng sinh đồ và họ hoàn toàn có thể dựa theo loại kháng sinh có hiệu quả nhất đối với vi khuẩn này thông qua các kết quả trong quá trình giám sát tính kháng thuốc được báo cáo thường quy hàng năm của mỗi khoa phòng, bệnh viện và khu vực trong một quốc gia. Việc đo MIC cho các kháng sinh điều trị, giúp các nhà lâm sàng dễ dàng điều chỉnh nồng độ thuốc điều trị tối ưu, hạn chế tác dụng phụ do thuốc và hạn chế sự kháng thuốc, gia tăng kết quả điều trị, giảm tỷ lệ tử vong và chi phí thấp nhất.
4.3. Phát hiện gen Oxacillinase và tìm mối tương đồng về kiểu gen A. baumannii 4.3.1. Phát hiện gen OXA của các chủng A. baumannii phân lập được
Phân tích 62 chủng A. baumannii phân lập được từ 267 bệnh nhân được chẩn đoán là NKH do A.baumannii, bằng kỹ thuật PCR-Multiplex, chúng tôi đã phát hiện gen OXA ở trên tất cả 62 chủng A. baumannii ở cả 6 BV từ 3 miền (Bắc, Trung và Nam). Trong đó 100% chủng A. baumannii đều có mang gen OXA_51 và 19 chủng chỉ mang 1 mình gen OXA_51 (30,6%), 36 chủng vừa mang gen OXA_51 và OXA_23 (58,1%) và 7 chủng vừa mang gen OXA_51 và OXA_28 (11,3%). Đặc biệt gen OXA_23 phát hiện ở cả 6 BV thuộc 3 miền Bắc, Trung, Nam. Trong khi gen OXA_58 chỉ phát hiện được ở Miền Bắc và Miền Nam Việt nam. Một điều đáng lo ngại là 56% các chủng A. baumannii phân lập được là từ khoa HSTC, còn lại trên 40% có thể nằm rải rác tại nhiều khoa phòng khác trong BV: 19% từ khoa Nội, 11% từ BN khoa Truyền nhiễm, 8% từ BN khoa Ngoại và 6% từ BN khoa Nhi và sự kháng KS thay đổi theo các chủng, có hay không mang gen kháng carbapenem mắc phải (OXA_23 và OXA_58) trong bệnh viện.
Đánh giá mức độ kháng KS bằng MIC với A. baumannii có mang gen oxacillinase kháng với nhóm β-lactam khác nhau ở 3 miền (Bắc, Trung và Nam) lần lượt như sau: với imipenem (77,7%; 63,6% và 70,8%), với meronem (63,9%; 54,5% và 70,8%), với ceftazidin (77,8%; 72,7% và 62,5%), với cefepim (22,2%; 45,45% và 29,1%), với amikacin (18,5%; 63,6% và 41,6%), với amikacin (18%; 63,6% và 41,6%) vớ ciprofloxacin (18,5%; 72,7% và 29,2%), với colistin cả 3 miền còn nhạy 100%. Đặc biệt, khi phân tích sự khác biệt giữa các nhóm A. baumannii
có và không có mang gen OXA_23, OXA_58, chúng tôi nhận thấy có sự khác nhau về tính kháng kháng sinh rõ rệt của những chủng A. baumannii: những chủng mang gen OXA_58 có tỷ lệ kháng KS cao hơn so với mang gen OXA_23: với imipenem (66,6% so với 100%), meronem (55,5% so với 100%), ceftazidine (91,67 so với 100%), và cefepim (30,5% so với 57,14%).
Tại Việt Nam năm 2014, Telda và CS. công bố đã phát hiện A. baumannii có mang gen OXA-23 tại hai bệnh viện Bạch Mai và Chợ rẫy [132]. Đã có rất nhiều NC ở các nước trong khu vực châu Á phát hiện được các gen OXA này như nghiên cứu của Yang và CS. (2009), đã phát hiện gen OXA_51 và OXA_ 23 trong các chủng A. baumannii phân lập tại BV ở Hàn Quốc, đồng thời cho thấy, các chủng mang những gen này kháng rất cao với tất cả các KS được thử nghiệm bao gồm kháng 100% với imipenem, meronem và ciprofloxacin, 97,9% với cefepim và ceftazidine, 57,1% với amikacin [145]. Một NC khác của Wang và CS. (2007), tại 11 bệnh viện của Trung quốc, từ năm 1999 – 2005, phát hiện các chủng này có mang gen OXA_23 (chiếm 97%), và chỉ có 187/221 (84,6%) chủng mang gen OXA_51 hay nói cách khác A. baumannii chiếm 84,6% các chủng Acinetobacter spp., với MIC đo được khá cao, với imipenem (16 – 64 µg/ml), meronem (16 - 128 µg/ml), ceftazidin (4 - >256 µg/ml), cefepim (4 - > 256 µg/ml), amikacin (1 - > 256 µg/ml), ciprofloxacin (0,25 - > 32 µg/ml), colistin (0,5 - 1 µg/ml) [140]. Một NC khác của Lin và CS. (2011), tại Đài Loan đã phát hiện ra 136 chủng Acinetobacter spp. phân lập từ năm 2005 – 2007, với 99% các chủng A. baumannii mang gen OXA_51 và cũng có sự xuất hiện gen kháng carbapenem như OXA_23, OXA_24 với MIC cho imipenem (>16 µg/ml), Ceftazidin (>32 µg/ml) [103], [93]. Nghiên cứu khác của Amudhan và CS. (2011), tại Ấn độ đã phát hiện được 116 chủng
Acinetobacter spp. trong đó có mang gen OXA_51 là 99 chủng và mang gen OXA_23 là 95 chủng, OXA_58 là 1 chủng. Như vây, tại các nước khu vực Châu Á, gen OXA được tìm thấy nhiều nhất vẫn là OXA_51, OXA_23 còn OXA_58 rất ít khi phát hiện được, trong khi đó ở NC của chúng tôi có đến 7 chủng A. baumannii
mang gen này và sự kháng thuốc của gen này là rất cao, cao hơn cả so với gen OXA_23. Nghiên cứu tại các quốc gia Châu Âu và Châu Mỹ cũng phát hiện các gen chủng mang gen OXA có tính kháng KS rộng rãi, như NC của Giannouli và CS. (2009), tại Ý chó thấy có 21/24 chủng A. baumannii kháng phân lập được kháng với carbapenem có mang gen OXA_58, với MIC nhạy cảm của imipenem và meronem
≥ 8 µg/ml [97], [62]. NC của Liakopoulos và CS. (2012), tại Hy lạp cho thấy, phát hiện gen OXA_ 23 chiếm 72,4% trong tổng số các chủng A. baumannii phân lập được và OXA_58 chỉ chiếm 27,6% trong tổng số các chủng A. baumannii trong năm 2010, nhưng sau đó tỷ lệ OXA_58 ngày càng tăng lên đáng lo ngại [92]. Huang và CS. (2012) nghiên cứu trên những người lính đánh trận từ Iraq trở về nằm điều trị tại bệnh viện ở Washington. DC - Mỹ cho thấy, trong 5 năm đã phát hiện ra 298 chủng A. baumannii, tất cả đều mang gen OXA_51, và chỉ có 40 chủng mang gen OXA_23 và 1 chủng mang gen OXA_58 [67].
Như vậy, đây là một nghiên cứu phát hiện gen oxacillinase đầu tiên với quy mô trên 6 bệnh viện, từ 3 miền Bắc, Trung, Nam của Việt Nam giúp xác định các chủng A. baumannii mang gen kháng KS nhóm β-lactam ở BN NKH do A. baumannii từ nhiều khoa phòng khác nhau (khoa HSTC chỉ chiếm 56% và gần một nửa còn lại, là từ nhiều khoa phòng khác nhau) trong 6 bệnh viện, đã phát hiện được gen OXA_51, một gen nội tại có tính chất định danh của chủng này và là gen mang yếu tố đề kháng tự nhiên. Và đây cũng là lần đầu tiên ở Việt Nam phát hiện trên quy mô nhiều bệnh viện có mang gen OXA_23 ở những chủng A. baumannii phân lập từ máu ở bệnh nhân NKH, từ nhiều khoa lâm sàng khác nhau bao gồm cả khoa HSTC, của 6 bệnh viện ở cả 3 miền Bắc Trung Nam. Đây là một gen thường được phát hiện ở nhiều quốc gia Châu Á như Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc, Hồng Kong, Hàn quốc, Singapor, Ấn Độ và cũng đã từng phát hiện ở nhiều quôc gia Châu Âu (Pháp, Italy), và ở Brazil, Mỹ, Libia, Pakinstan. Gen OXA-23 là một gen được mã hóa nằm trên nhiễm sắc thể và plasmid của A.baumannii, có khả năng kháng cao với KS nhóm carbapenem và khi A. baumannii mang gen này nó có thể kháng với nhiều loại kháng sinh khác như các KS cephalosporin (CAZ, CFP), Kháng với aminoglycoside (AMK, GEN), và đồng thời là gen kháng thuốc mà vi khuẩn có thể truyền yếu tố kháng thuốc trong cùng một loài hoặc khác loài làm khó khăn trong điều trị và phòng ngừa.
Và đây cũng là nhiên cứu lần đầu tiên phát hiện gen OXA-58 trong bệnh phẩm máu ở hai miền Bắc và Nam, một gen kháng thuốc thường chỉ được tìm thấy ở các quốc gia Châu Âu với số lượng không nhiều và rất hiếm khi phát hiện ở Châu Á. Một gen có khả năng đề kháng với kháng sinh rất cao với nhiều loại kháng sinh và có khả năng lây truyền tính kháng thuốc trong và khác loài qua plasmid và NST. NC ở chúng tôi cho thấy, tỷ lệ A. baumannii mang gen này kháng 100% với cả hai kháng sinh thuộc nhóm carbapenem là imipenem và meronem, đây thực sự là một điều đáng lo ngại cho nhà lâm sàng nếu như gen này phát tán rộng rãi ở các bệnh viện Việt Nam.
Tại Việt Nam, việc phát hiện ra các gen kháng thuốc OXA-51, OXA-23, OXA-58 ở trên quy mô nhiều khoa phòng khác nhau, nhiều bệnh viện khác nhau ở 3 miền của Việt Nam là một thách thức. Bởi vì, A. baumannii là một tác nhân gây bệnh có khả năng sống sót cao trên người, động vật và môi trường trong điều kiện khô ráo và ẩm ướt, nó có thể lây lan qua đường tiếp xúc, không khí và dụng cụ lây nhiễm. Bởi vì khả năng sống sót cao như vậy, cho nên nó trở thành một tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và có khả năng kháng với nhiều loại kháng sinh, kể cả những kháng sinh đặc trị cho chúng như nhóm kháng sinh Carbapenem. Cơ chế đề kháng của A. baumannii rất phong phú, nó có thể kháng qua con đường sản xuất ra các men β-lactamase, Carbapenase, Metaloenzyme làm thuỷ phân các nhóm kháng sinh đặc trị cho chúng. Ngoài ra nó còn làm giảm tính thấm kháng sinh do bị mất các lỗ porin, làm giảm sự thâm nhập của kháng sinh vào trong nhân vi khuẩn. Việc làm biến đổi protein gắn kết trên màng tế bào (BP) làm giảm tác dụng của kháng sinh lên vi khuẩn. Chủ yếu nhất vẫn là cơ chế đề kháng liên quan đến các gen có khả năng thủy phân men carbapenemase mắc phải nằm trong lớp D (Class D) của vi khuẩn (Oxacillinase). Gen kháng carbapenemase nằm trong lớp D thường được chia thành 4 nhóm có tương đồng về kiểu gen như sau: OXA-23 (bao gồm OXA-23, OXA_27 và OXA_49). OXA_24 (bao gồm OXA_24, OXA_40, OXA _25, OXA_26 và OXA_72). OXA-58 (bao gồm OXA-58, OXA_96). Và OXA-51 (là
một gen nội tại kháng tự nhiên với carbapenem và chỉ nằm trên A. baumannii, gen OXA-23 lần đầu tiên được mô tả ở Scottland (1995) trong các vụ dịch và hiện nay nó trở thành gen phát tán rộng rãi ở nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt là ở các nước Châu Á. Gen OXA-58 được tìm thấy chủ yếu ở Châu Âu, rất ít báo cáo ở Châu Á [13], [98], [99]. Một điều đáng lo ngại hơn cả là sự gia tăng kháng KS này bắt đầu trỗi dậy từ năm 2006 của những gen OXA có khả năng lan truyền tính kháng KS qua plasmid do vậy, việc phát tán và lây lan trong cộng đồng bệnh viện và ngoài bệnh viện, liên vùng trong một quốc gia, thậm chí liên lục địa là rất quan trọng và gây khó khăn cho việc kiểm soát và ngăn ngừa sự lây nhiễm này [38], [115].
4.3.2. Tìm mối tương đồng về kiểu gen của chủng A. baumannii phân lập được
Áp dụng kỹ thuật PFGE phân tích 76 chủng A. baumannii phân lập từ 6 bệnh viện cho thấy, có 16 chùm (Cluster) được ký hiệu từ I đến XVI có mức độ tương đồng về kiểu gen giữa các chủng A. baumannii từ 89,5 % đến 100 %. Đặc biệt chùm IV, gồm có 13 chủng A. baumannii có độ tương đồng cao lên đến 96,4% và phân lập được ở cả 4 bệnh viện và cả 3 miền: Bắc (1 từ BVBM), Trung (8 từ BVTWH) và Nam (2 từ BVCR và 2 từ BVND). Trong đó có 8 chủng được phân lập ở tại BVTWH, như vậy phải chăng chủng A. baumannii này có nguồn gốc từ 1 bệnh viện và phát tán sang các BV khác hoặc ngược lại, và đó cũng là điều đặt ra cho các nhà lâm sàng, nhà kiểm soát nhiễm khuẩn và vi sinh, cần phải làm gì tiếp theo để có thể biết rõ con đường lưu hành của các chủng này cũng như tìm nguồn lây nhiễm, đường lây để kịp thời ngăn chặn sự phát tán tiếp tục của các chủng này.
Khi phân tích các chủng A. baumannii kháng với carbapenem, nghiên cứu của chúng tôi cũng đã phát hiện 3 chùm (A, B, C) gồm 20 chủng A. baumannii phân