Việc định danh và mô tả yếu tố dịch tễ bằng phương pháp sinh học phân tử những chủng A. baumannii phân lập từ các trường hợp NKH xẩy ra theo thời gian, không gian là hết sức quan trọng, giúp xác định nguồn gốc và cách lây truyền. Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng, từ kỹ thuật đơn giản như định phage, định danh dựa trên huyết thanh, cho tới kỹ thuật sinh học phân tử phức tạp, đòi hỏi trình độ, phương tiện máy móc hiện đại như phân tích plasmid, ribosom, kỹ thuật điện xung trường (Pulse field gel electrophoresis: PFGE), kỹ thuật phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ plymerase (Single PCR/ Multiplex –PCR (Polymerase Chain Reaction), kỹ thuật phân tích đa hình các đoạn enzyme khuyếch đại RAPD, AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism PCR), kỹ thuật giải trình tự gen (Multilocus Sequence Typing-MLST) [128]. Song, kỹ thuật sinh học phân tử được chọn lựa nhiều nhất hiện nay NC về sinh học phân tử là:
PFGE (Pulse field gel electrophoresis):
Nguyên lý của kỹ thuật này là phân tách ADN trên nhiễm sắc thể bằng các enzym giới hạn để tạo ra các đoạn ADN với các kích cỡ khác nhau làm cơ sở tạo nên các kiểu hình ADN khác nhau bằng điện di gel agarose.
Kỹ thuật PFGE có khả năng tách những đoạn ADN có kích thước rất lớn (> 50 kb) thành những đoạn có kích thước nhỏ dựa trên nguyên tắc đổi hướng định kỳ điện trường xung trong quá trình điện di. PFGE là kỹ thuật có hiệu lực phân biệt, khả năng lặp lại cao và thường được chọn lựa cho nhiều nghiên cứu dịch tễ học phân tử của các NKBV, các vụ dịch do các tác nhân gây bệnh gây ra.
PFGE cho đến hiện nay vẫn được xem là "tiêu chuẩn vàng - gold standard" của kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong phân loại vi khuẩn không chỉ riêng cho
Acinetobacter mà còn cho nhiều loại mầm bệnh khác nhau [31], [58], [60], [69]. Việc sử dụng kỹ thuật PFGE, với những phân tích kết quả về kiểu gen, dựa trên sự
tương đồng của các băng dải (band) của ADN để có thể cho biết mức độ tương đồng về kiểu gen của các chủng vi khuẩn (bảng 1.2), từ đó có thể giúp nhà lâm sàng và dịch tễ nhận định về các chủng vi khuẩn được phân tích.
Bảng 1.2: Tiêu chuẩn tương đồng về kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE
Số đoạn ADN khác nhau Mối liên quan
0 Không thể phân biệt được (Indistinguishabble) 2 – 3 Có mối liên quan gần (Closely related)
4 – 6 Có thể có liên quan (Possbly related) ≥ 7 Khác nhau hoàn toàn (Different)
Fred C. Tenover và CS.(1995)[56].
Tenover và CS. năm 1995, đã đưa ra một hệ thống tiêu chuẩn để giải thích những mẫu PFGE trong mối tương đồng về kiểu gen để xác định sự liên quan giữa các chủng vi khuẩn phân lập được. Trong đó, những chủng vi khuẩn nào có sự tương đồng sẽ tạo ra các mẫu PFGE hoàn toàn giống nhau được xem là có nguồn gốc từ một chủng (Indistinguishabble). Hiện nay, với sự giúp đỡ của máy tính và các phần mềm phân tích kết quả điện di trên thạch PFGE có thể tạo ra ngân hàng số liệu về những mẫu phân tích ADN với hầu hết tất cả các loại vi khuẩn mong muốn được đối chiếu và nghiên cứu.
Vì vậy, những mẫu phân tích này có thể tạo ra cơ sở dữ liệu để tham khảo, so sánh đối chiếu với một số chủng cũ hoặc mới, giúp xác định quan hệ phát sinh loài hình 1.3 (phylogenetic relationship) [128], [125], [137].
Hình 1.3: Kỹ thuật PFGE xác định kiểu ADN của A.baumannii [31], [125]
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Đây là kỹ thuật phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase phát hiện gen kháng KS do Kary Mullis và CS. phát hiện năm 1985. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý tổng hợp đoạn AND trong tế bào được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn.
Quá trình tổng hợp AND được bắt đầu theo chu trình: hai sợi AND làm khôn mẫu bị tách ra dưới tác dụng của nhiệt độ. Hai đoạn mồi oligonucleotide từ 20-40 nucleotide sẽ gắn vào các vị trí bổ sung trên đoạn AND mẫu. Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ được kéo dài về hai phía, tạo ra đoạn AND mới bổ sung với đoạn khuôn mẫu. Với một cặp mồi đặc hiệu một đoạn AND nào đó sẽ được tổng hợp sau mỗi chu kỳ nhiệt của PCR. Hàng triệu bản sao sẽ được tổng hợp trong thời gian ngắn và chúng ta có thể phát hiện được các đoạn gen đặc hiệu cần khuyếch đại trên thạch điện di.
Kỹ thuật Multiplex - PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn AND mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi (primer) trong một phản ứng. Multiplex – PCR lần đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988, và kể từ đó đến nay đang được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực y học, sinh học và nông nghiệp với nhiều mục đích khác nhau như phát hiện các căn nguyên gây bệnh do vi khuẩn hay phát hiện gen kháng kháng sinh của các vi khuẩn [128], [137].
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU