Nghiên cứu đặc điểm chung của NKH do A.baumannii
- Giới tính: nam, nữ.
- Tuổi: người lớn >15 tuổi, trẻ em (từ sơ sinh đến ≤ 15 tuổi) chia 4 nhóm: sơ sinh (1-30 ngày tuổi), 1 tuổi (1-12 tháng), 2 tuổi - 5 tuổi, 6 tuổi - 15 tuổi.
- Ngày nằm viện: tính từ khi nhập viện đến khi xuất viện, thời gian nằm viện được phân tầng theo số ngày nằm viện dưới 2 ngày, trên 2 ngày- 7 ngày, từ 8 – 14 ngày, từ 15 – 28 ngày và trên 28 ngày (dựa trên thời gian nguy cơ nhiễm khuẩn mắc phải trong bệnh viện qua nhiều nghiên cứu đã thực hiện) đối với NKH do A. baumannii [33].
- Hình thức nhập viện: bệnh nhân tự đến hay được nhập viện từ một cơ sở y tế khác đưa đến.
- Ổ nhiễm khuẩn ban đầu: là ổ nhiễm khuẩn có trước khi cấy máu dương tính với
A. baumannii và được xác định dựa trên thăm khám lâm sàng và cận lâm sàng (cấy nước tiểu, cấy dịch nội khí quản, vết thương, vết bỏng và vết mổ; chẩn đoán hình ảnh,…).
- Tình trạng bệnh mạn tính đi kèm lúc nhập viện:
+ Ở người lớn: COPD, bệnh lý ở gan, thận, tiêu hóa và sử dụng thuốc ức chế miễn dịch, ung thư, …
+ Ở trẻ em: tình trạng suy dinh dưỡng, béo phì, dị tật bẩm sinh, đang điều trị thuốc ức chế miễn dịch, ung thư, …
- Tình trạng nhiễm khuẩn lúc nhập viện: có bất kỳ tình trạng nhiễm khuẩn ngay lúc nhập viện được xác định trên lâm sàng và cận lâm sàng: viêm phổi, nhiễm khuẩn đường tiểu, tiêu hóa, thần kinh, da và mô mềm, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn vết mổ, ….
Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng nhiễm khuẩn huyết do A.baumannii
Các triệu chứng lâm sàng được theo dõi từ lúc nhập viện đến khi cấy dương tính với A. baumannii và khi có SNK theo lứa tuổi và diễn tiến điều trị (bệnh nhân còn sống hay tử vong) theo tiêu chuẩn của theo Knaus và Goldstein [35], [45], [82], bao gồm các triệu chúng như sau:
- Nhiệt độ: nhiệt độ (cặp ở hõm nách) được đo vào các thời điểm:
+ Cấy máu dương tính: nhiệt độ đo được vào thời điểm có chỉ định cấy máu (dương tính với A. baumannii).
+ Sốc nhiễm khuẩn: nhiệt độ đo được vào thời điểm có SNK trên lâm sàng. + Nhiệt độ được xác định 3 mức: từ 360C – 38,50C; < 360C (hạ thân nhiệt) và > 38,50C (sốt)
+ Ở người lớn chia 3 mức giới hạn: có rối loạn tim mạch (mạch nhanh > 90 lần/phút, chậm < 50 lần/phút) và trong giới hạn bình thường (50 - ≤ 90 lần/phút).
+ Ở trẻ em: dựa theo chỉ số nhịp tim theo nhóm tuổi của Goldstein và CS. năm 2005 (Bảng 1.3).
- Hô hấp: xác định tần số thở/phút (lần/phút), chia 3 khoảng giới hạn theo lứa tuổi: nhanh, trong giới hạn bình thường và có hỗ trợ hô hấp hay không (bao gồm: thở máy, đặt nội khí quản bóp bóng, mở khí quản).
+ Ở người lớn: thở nhanh > 50 lần/phút, trong giới hạn bình thường từ 20 – < 50 lần/phút và phải hỗ trợ hô hấp.
+ Ở trẻ em: có hỗ trợ hô hấp, thở nhanh, thở bình thường dựa theo chỉ số nhịp thở theo nhóm tuổi (Bảng 1.3).
- Huyết áp động mạch: chỉ lấy ở bệnh nhân người lớn, lấy kết quả đo được ở thời điểm chẩn đoán NKH với A. baumannii và khi có SNK như sau: + Huyết áp tâm thu: chia mức độ ≤ 90 mmHg và > 90 mmHg.
- Mức độ nặng của bệnh nhân : Được đánh giá dựa trên:
+ Ở người lớn: có hôn mê (theo thang điểm glasgow), có sốc và đánh giá theo thang điểm APACHE II.
+ Ở trẻ em: có hôn mê, có sốc.
- Hội chứng đám ứng viêm hệ thống (SIRS) trong chẩn đoán NKH do A. baumannii: phải có ≥ 2/4 tiêu chuẩn sau:
+ Nhiệt độ tăng > 38,5 °C hoặc < 36 °C.
+ Tần số tim > 90 lần/phút ở người lớn và trên 2 độ lệch chuẩn (2SD) so với giá trị bình thường theo tuổi ở trẻ em (bảng 1.1).
+ Tần số thở > 20 lần/phút hoặc PaCO2 < 32 mmHg (tự thở) ở người lớn và > 2SD so với giá trị bình thường theo tuổi ở trẻ em (bảng 1.1).
+ Bạch cầu đa nhân trung tính: ở người lớn >12 000 hoặc < 4000/mm3, ở trẻ em thay đổi theo lứa tuổi (Bảng 1.3) hoặc > 10% bạch cầu non.
Bảng 2.1: Nhịp tim, nhịp thở, huyết áp, bạch cầu ở trẻ em theo tuổi Nhóm tuổi Nhịp tim (lần/phút)* Nhịp thở Lần/ph* HA tâm thu mmHg BC máu** (BCx103/mm3 Nhanh Chậm 0 – 1 tuần >180 <100 >50 <65 >34.0 1t - 1 tháng >180 <100 >40 <75 >19,5 hoặc <5 1th – 1 năm >180 <90 >34 <100 >17,5 hoặc <5 2 – 5 năm >140 Không YN >22 <94 >15,5 hoặc <6 6 – 12 năm >130 Không YN >18 <105 >13,3 hoặc <4.5 13 – 18 năm >110 Không YN >14 <117 >11 hoặc <4.5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(*): 5 percentile (bách phân vị) cho giá trị cao của nhịp tim và nhịp thở. (**): 15 percentile cho giá trị của bạch cầu máu ngoại vi; (): Không ý nghĩa
(Theo Brahm Goldstein và CS.(2005) [35].
- Các thủ thuật xâm lấn: can thiệp trong chẩn đoán và điều trị đi kèm: thở máy, mở khí quản. đặt catheter mạch máu trung tâm, chạy thận nhân tạo, lọc máu, đặt thông tiểu, phẫu thuật.
Nghiên cứu đặc điểm cận lâm sàng nhiễm khuẩn huyết do A.baumannii
Các dữ liệu cận lâm sàng được thu thập và theo dõi ở thời điểm xác định NKH do A. baumannii và khi có SNK, theo các đánh giá tình trạng bình thường, NKH, NKH nặng và SNK của các tài liệu hướng dẫn về tiêu chuẩn chẩn đoán NKH của Việt nam và thế giới [1], [5], [34], [47] như sau:
Các xét nghiệm huyết học:
- Hồng cầu (số lượng HC/mm3): số lượng HC chia 3 mức độ tăng, trong giới hạn bình thường và giảm theo lứa tuổi ở trẻ em (bảng 1.1) và người lớn.
- Bạch cầu (số lượng BC/mm3): ở trẻ em chia theo lứa tuổi (bảng 1.1) và ở người lớn giảm < 4000/ mm3 hoặc tăng BC > 12 000/ mm3 vàtrong giới hạn bình thường (từ 4000/ mm3 - 12 000/ mm3).
- Hemoglobin (g/l): chia khoảng giới hạn ≤ 100 g/l và > 100 g/l, theo phân loại về thiếu máu cũng như tiên lượng điều trị trong NKH nặng và SNK cần phải truyền máu.
- Tiểu cầu (G/l): chia khoảng < 100 G/l và ≥ 100 G/l, để đánh giá rối loạn chức năng đông máu, và chỉ định phải truyền máu trong NKH nặng và SNK.
Xét nghiệm đông máu: được tính trên giá trị trung bình và chia khoảng
- Tỷ lệ Prothrombin (%): chia hai khoảng ≤ 50% và trên 50%.
- Thời gian máu đông (giây): chia khoảng < 15 giây và ≥ 15 giây.
- aPTT (Thời gian hoạt hóa một phần thromboplastin tính bằng giây): chia hai khoảng (< 60 giây và ≥ 60 giây).
- INR (Tỷ số chuẩn hóa quốc tế): chia khoảng ≤ 1,5 và > 1,5.
Chức năng thận: được tính trên giá trị trung vị và chia khoảng
- Creatinin máu (mg/dl): tính trung vị,
- Lactate (mmol/l): tính giá trị trung vị,
- CRP (mg/dl): tính giá trị trung bình.
- Procalcitonin (ng/l): tính giá trị trung vị
Diễn tiến điều trị: bệnh nhân còn sống hay tử vong,
2.3.2. Nghiên cứu mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng A. baumannii
Kỹ thuật nuôi cấy định danh vận chuyển và lưu trữ các chủng A. baumannii
từ các bệnh viện nghiên cứu
Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy thường qui của Tổ chức Y Tế Thế giới
- Môi trường nuôi cấy để tiến hành chẩn đoán A. baumannii bằng 3 loại môi trường: Blood Agar của hãng BioRad thêm 7% máu thỏ hoặc cừu và môi trường Mac conkey,
- Các trường hợp cấy Acinetobacter dương tính từ mỗi bệnh viện sẽ được cho ngay vào canh cấy Tryptone Soya do hãng SANOFI cung cấp, sau đó các chủng
A. baumannii này sẽ được lưu mẫu trong tủ âm sâu 700C và cuối cùng sẽ được chuyển về Bệnh viện Trung ương quân đội 108 định danh, xác định chủng A. baumannii một lần nữa theo tiêu chuẩn về sinh hóa và chạy bằng máy định danh tự động,
- Môi trường bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm: sử dụng canh thang Tryptone Soya do hãng SANOFI cung cấp. Các chủng vi khuẩn sẽ được bảo quản trong tủ lưu giữ mẫu ở nhiệt độ âm (- 700C),
- Cách vận chuyển: bệnh phẩm sau khi được lấy từ tủ âm, cho vào hộp vận chuyển mẫu lạnh được bảo quản bằng đá khô, vận chuyển nhanh bằng đường máy bay ra thẳng khoa vi sinh Viện nghiên cứu khoa học Y Dược lâm sàng 108 và sau đó tiếp tục được lưu trong tủ âm (- 700C), cho đến khi làm các mục tiêu nghiên cứu đã được định ra. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kỹ thuật đo MIC, phát hiện gen OXA và tìm mối liên quan kiểu gen của các chủng A. baumannii phân lập được:
Các bệnh phẩm sau khi lưu trữ tại Viện nghiên cứu khoa học Y Dược lâm sàng 108 sẽ được nuôi cấy xác định lại và tiến hành các xét nghiệm đo MIC và sinh học phân tử:
- Kỹ thuật định danh A. baumannii:
Bằng máy với 2 kỹ thuật (kiểm chứng) độ chính xác như sau:
+ Dùng bộ kít API 20NE của Hãng Bio Mereux tìm tính chất sinh vật hóa học để định danh A. baumannii,
+ Sử dụng hệ thống định danh tự động Phoenix 100.
+ Kết quả được xử lý theo chương trình WHONET 5.6 và Epi-info.
Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu được thực hiện trên hệ thống định danh vi khuẩn và đo MIC tự động Phoenix 100 của hãng Becton Dickinson (BD) Hoa Kỳ.
Sử dụng panel định danh có sẵn kháng sinh được chọn thử nghiệm MIC cho vi khuẩn Gram âm: NMIC/ID 123, NMIC/ID 134…Theo đó, vi khuẩn được pha vào ID broth đạt nồng độ 0,5 McFaland (đo độ đục bằng máy Spex Nephelometer). Chuyển 25 l dung dịch vi khuẩn trên vào AST broth đã cho 01 giọt chỉ thị màu (AST indicator), lắc nhẹ bằng cách đảo lên xuống 5-10 lần. Cho toàn bộ dung dịch trong ID broth vào khay ID và dung dịch trong AST broth vào khay AST trên panel NMIC/ID. Để 15 phút ở nhiệt độ phòng sau đó cho các thanh panel vào máy Phoenix 100 theo đúng chỉ dẫn.
Kết quả định danh tên vi khuẩn và giá trị MIC của vi khuẩn đó với từng loại kháng sinh sẽ được hệ thống máy tính tính toán và cho ra kết quả cuối cùng bằng phiếu kết quả được in ra trên giấy.
Điểm gẫy MIC được xác định theo giá trị MIC chuẩn cho A. baumannii theo CLSI 2012 và WHONET 5.6.
Bảng 2.2: Điểm gãy của kháng sinh nhóm carbapenem với A. baumannii
Kháng sinh
Điểm gãy theo CLSI 2012 MIC (µg/mL) Nhạy Trung gian Kháng
Imipenem ≤4 8 ≥16
Meronem ≤4 8 ≥16
Nguồn CLSI 2012 [42]
2.3.3. Phát hiện gen Oxacillinase, tìm mối tương đồng về kiểu gen A. baumannii Sử dụng Kỹ thuật Multiplex PCR phát hiện gen OXA như sau
Nguyên vật liệu
- Trên thế giới từ trước đến nay có rất nhiều đoạn mồi giúp phát hiện các gen OXA kháng sinh được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu để phát hiện các gen OXA (OXA_51, OXA_23, OXA_58) có cấu trúc các nucleotide tương tự như cấu trúc các đoạn mồi đã được thực hiện trong các nghiên cứu của N. Woodford và và CS. năm 2006 (Bảng 2.4) [142], [144].
- Chứng dương cho gen OXA là ADN khuôn mẫu được tách chiết từ các chủng
A. Baumannii mang các gen OXA được nghiên cứu.
- Nguồn cung cấp các đoạn mồi và chứng dương từ Viện Quốc gia các bệnh truyền nhiễm Nhật Bản.
- Các đoạn mồi được dựa trên trình tự xắp xếp kiểu gen của Woodford và CS. năm 2006, đã được ứng dụng và sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu của các tác giả khác nhau trên thế giới [144].
Bảng 2.3: Trình tự xắp xếp của các đoạn mồi sử dụng phát hiện gen OXA
Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’)
Kích thước (bp)
Tài liệu tham khảo
OXA_58-F 5’-AAG TAT TGG GGC TTG TGC TG-3’
599 Woodford et al, OXA_58-R 5’-CCC CTC TGC GCT CTA CAT AC-3’ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
OXA_51-F 5’-TAA TGC TTT GAT CGG CCT TG-3’
353 Woodford et al, OXA_51-R 5’-TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG-3’
OXA_23-F 5’-GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA-3’
501 Woodford et al, OXA_23-R 5’-ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT-3’
Woodford et al, 2006 [144].
Kỹ thuật thực hiện
- Lấy 3-4 khuẩn lạc trên đĩa thạch nuôi cấy hòa vào 200 µl nước cất vô trùng, đun cách thủy trong vòng 3 phút và ly tâm lấy nước nổi để làm khuôn mẫu ADN.
- Các đoạn mồi đặc hiệu phát hiện các gen OXA (OXA_51, OXA_23, OXA_58) được trình bày tại bảng 2.5, với trình tự xắp xếp tương tự như Woodford và CS.,
năm 2006 đã thực hiện.
- Chứng dương gen OXA là ADN khuôn mẫu tách chiết từ các chủng vi khuẩn A. baumannii mang các gen OXA do Viện Quốc gia các bệnh truyền nhiễm Nhật Bản cung cấp.
- Thành phần tham gia phản ứng PCR bao gồm: 25 µl Go Taq Master Mix (Promega); 1µl hỗn hợp mồi; 5µl khuôn mẫu ADN và 19µl nước tinh sạch.
- Chu trình nhiệt: cho gen OXA (94 0C trong 5 phút; 30 chu kỳ bao gồm: 94 0C trong 25 giây, 52 0C trong 40 giây, 72 0C trong 50 giây; và 72 0C trong 6 phút). Sản phẩm PCR sẽ được điện di trên thạch 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X, nhuộm thạch và chụp ảnh gel dưới ánh sáng tia cực tím.
- Các gen OXA chứng dương được sử dụng để đánh giá mẫu thử nghiệm và số liệu được quản lý bằng phần mền Excel.
Kỹ thuật PFGE xác định kiểu hình của gen chủng A.baumannii
Thực hiện tại phòng xét nghiệm Vi khuẩn học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Hà Nội, cụ thể như sau:
- Pha loãng và đo độ đục vi khuẩn (Chủng A. baumannii đã được định danh sẽ được nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau đó được lấy ra hòa vào thạch lỏng rồi đổ vào những khuôn nhỏ),
- Gắn vi khuẩn vào thạch (Miếng thạch sau khi đổ được cắt và tạo các nút thạch nhỏ chứa toàn bộ tế bào vi khuẩn).
- Ly giải và cắt AND của vi khuẩn bằng Protein K và XbaI (Vi khuẩn được cố định trong thạch sẽ chịu tác dụng của Protein K sẽ ly giải tế bào vi khuẩn giải phóng toàn bộ ADN, tiếp theo ADN của vi khuẩn sẽ bị giáng hóa dưới tác dụng phân cắt tại những vị trí đặc hiệu bởi enzym giới hạn XbaI).
- Điện di thực hiện bằng máy điện trường xung (PFGE). Các nút thạch chứa ADN
A. baumannii sau khi được phân cắt, đặt vào các giếng tương ứng trên khuôn thạch agarose và tiến hành điện di. Quá trình điện di được thực hiện với dòng điện thay đổi ở các khoảng xác định trước sao cho điện trường cho phép các đoạn ADN có kích thước lớn khoảng 10 - 800 kb phân tách rời được với nhau.
- Nhuộm gel và chụp ảnh (Mẫu thạch sau điện di sẽ được nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang như ethidium bromide và quan sát dưới đèn cực tím (UV light). Hình ảnh bộ gen của VK được chụp bằng máy chụp GelDoc (BIO-RAD) và phân tích chùm VK bằng phần mềm Fingerprinting II (BIO-RAD). Các chùm VK được thể hiện qua biểu đồ cây (dendrogram). Các chủng A. baumannii có mức độ tương đồng về kiểu gen ADN ≥ 90% được xem có quan hệ di truyền chặt chẽ [29], [125].
2.4. Phương pháp xử lý số liệu Nhập dữ liệu: Nhập dữ liệu:
Số liệu nhập và quản lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Epidata.
Mô tả và phân tích dữ liệu theo mục tiêu đề tài:
- Biến số rời, định lượng: trình bày dưới dạng tỷ lệ phần trăm, trung bình (bao gồm độ lệch chuẩn- Mean ± SD) và trung vị (bao gồm bách phân vi 50% và khoảng dao động từ 1% đến 99% - Media, range 1-99%).
- Các bước thực hiện phân tích số liệu: So sánh tỷ lệ phần trăm bằng phép kiểm χ2. So sánh trung bình bằng phép kiểm student (t).
- Phân tích đơn biến bằng phép kiểm χ2, nguy cơ tương đối OR để xác định yếu tố nguy cơ tử vong ở nhóm bệnh nhân NKH còn sống và tử vong với những giá trị lâm sàng và cận lâm sàng.
- Biến số rời: kiểm định mối liên hệ giữa các biến số rời với diễn tiến điều trị