2.3.5.1. Nguyên tắc (giống 2.3.4.1) 2.3.5.2.Phƣơng pháp tiến hành
Chuẩn bị 2 ống nghiệm vô trùng, cho vào mỗi ống 10ml dịch vi khuẩn
(E.Coli hoặc Bacillus subtilis). Cho vào ống nghiệm thứ nhất màng Polyurethane (kích
thước 1cm x 9cm x 0,6cm) có chứa nano bạc (ống thí nghiệm). Với ống nghiệm thứ hai cho vào màng Polyurethane (kích thước 1cm x 9cm x 0,6cm) không chứa nano bạc (ống đối chứng). Sau khoảng thời gian 15 phút các màng được lấy ra cho vào ống
33
nghiệm vô trùng rồi vắt để thu lấy nước đã được xử lý. Nước này được được pha loãng đến các nồng độ 103, 104, 105. Từ mỗi nồng độ lấy 100 µl đem trải lên môi trường
Nutrient Agar. Ủ ở 370C trong 24 giờ rồi đếm số khuẩn lạc thu được
Cách tính kết quả theo phương trình (2.1) và (2.2)
2.3.6. Phương pháp phân tích Coliforms, E.coli từ nguồn nước do Công Ty Thành Long cung cấp trước và sau khi xử lý với tấm PU/Ag
Coliforms là nhóm trực khuẩn đường ruột gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí
hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37oC trong 24-
48 giờ. Do đó, môi trường được sử dụng để định lượng thường có chứa lactose để trắc nghiệm khả năng sinh hơi và có chất ức chế vi khuẩn Gram dương (muối mật).
E.coli thuộc nhóm Fecal Coliforms có khả năng thủy phân tryptophan trong môi
trường tạo ra indol, lên men đường glucose thật mạnh thành các sản phẩn acid rất bền, không sinh aceton, không sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất.
2.3.6.1. Nguyên tắc
Phương pháp MPN (phương pháp số có xác xuất cao nhất) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Phương pháp này dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau để xác định lượng vi sinh vật trong mẫu [9].
Phương pháp này thường được thực hiện trên mẫu ở vài nồng độ pha loãng khác nhau, trong đó phương pháp 3 nồng độ được dùng phổ biến nhất.
2.3.6.2.Phương pháp tiến hành a. Định lượng Coliforms
Mẫu nước được cho chảy qua hai tấm lọc Polyurethane riêng biệt: (1) tấm PU có chứa nano bạc (mẫu thí nghiệm) và (2) tấm PU không chứa nano bạc (mẫu đối chứng). Nước qua lọc được thu vào một bình chứa sạch.
Cấy 10ml mẫu nước vào ống chứa 10ml môi trường LSB đôi : 3 ống Cấy 1 ml mẫu nước vào ống chứa 10ml môi trường LSB đơn : 3 ống Cấy 0.1 ml mẫu nước vào ống chứa 10ml môi trường LSB đơn : 3 ống Ủ ở 37,0 ± 0,5o
C trong 24-48 giờ
34
Ủ ở 37,0 ± 0,5oC trong 24-48 giờ
Đếm số lượng ống (+) (sinh hơi) trong từng dãy
Tra bảng MPN tương ứng để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/100ml
b. Định lượng E.coli
Chọn các ống sinh từ môi trường LSB cấy sang môi trường canh EC. Ủ ở 44,5 ± 0,5oC trong 24 giờ
Chọn các ống sinh hơi cấy sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủ các đĩa này ở 37,0 ± 0.5oC trong 24-48 giờ
Các khuẩn lạc tròn, tâm đen, phẳng, có hoặc không có ánh kim là khuẩn lạc
E.coli giả định.
Chọn các khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1mm để kiểm tra xác định chắc chắn
E.coli theo nghiệm pháp IMViC (Indol, Methyl red, Voges Proskuer, Citrate) như sau:
*Phản ứng Indol
Một số vi khuẩn có khả năng sinh ra enzyme thủy phân tryptophan có trong môi trường nuôi cấy tạo thành indol. Chất này sẽ kết hợp với paradimethyl amino benzaldehyde có trong thuốc thử Kovac’s cho hợp chất màu đỏ.
Tiến hành: Dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường canh trypton. Ủ ở 37oC trong 24 giờ. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào, quan sát màu nếu xuất hiện vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường là phản ứng dương tính, ngược lại không xuất hiện vòng đỏ là phản ứng âm tính.
*Phản ứng Voges Proskauer
Một số vi khuẩn lên men đường glucose tạo thành chất trung hòa acetyl methyl carbinol hay aceton. Chất này bị oxy hóa trong môi trường kiềm rồi kết hợp với α- napthol cho màu đỏ hồng.
Tiến hành: Dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường
canh MR-VP. Ủ ở 37oC trong 24-48 giờ. Lấy 1ml canh khuẩn từ môi trường MR-VP
cho vào ống nghiệm vô trùng, nhỏ 0,6ml α – napthol và 0,2ml NaOH 40%, lắc đều và để 2 giờ, quan sát màu môi trường, nếu chuyển từ vàng sang đỏ hồng là phản ứng dương tính, nếu không đổi màu là phản ứng âm tính.
35 *Phản ứng Methyl-red
Phản ứng này dùng để phân biệt hai loại vi khuẩn và hình thức lên men đường glucose. Loại lên men đường glucose thật mạnh thành các sản phẩn acid rất bền làm cho pH của môi trường thay đổi MR (+). Loại lên men đường glucose thành các sản phẩm trung gian kém bền, các chất này biến thành chất trung hòa cuối cùng MR (-). Tiến hành: Ủ môi trường canh thang MR-VP trong 24-48 giờ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử methyl-red vào lắc đều và quan sát màu môi trường, nếu chuyển từ vàng sang đỏ là phản ứng dương tính, nếu không đổi màu là phản ứng âm tính.
*Phản ứng Simmon Citrate
Một số vi khuẩn sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất cho hoạt động trao
đổi chất. Khi citrate bị biến dưỡng đến giai đoạn cuối cùng là CO2 có sự mất cân bằng
về ion làm pH môi trường thay đổi sang kiềm, môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang xanh dương.
Tiến hành: Dùng que cấy vô trùng ria khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường thạch
nghiêng Simmon Citrate. Ủ ở 37oC trong 24-48 giờ. Môi trường có màu xanh dương là
phản ứng dương tính, còn màu xanh lá cây là phản ứng âm tính.
Các ống canh khuẩn mà lên men lactose, sinh hơi trong môi trường EC, tạo được khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB và cho kết quả thử nghiệm IMViC
++-- là ống có E.coli (+). Ghi nhận số ống nghiệm có E.coli (+) và tra bảng MPN để
tính ra mật độ E.coli trong mẫu.
2.3.7.Phương pháp phân tích hóa lý dung dịch nano bạc và vật liệu PU/Ag
Kích thước hạt nano bạc trong dung dịch keo được xác định bằng phương pháp xác định bước sóng hấp thu UV-Vis ((Phòng TNCNNano); phương pháp chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (ĐHBK TP.HCM).Các phương pháp phân tích cấu trúc vật liệu PU/Ag: Raman (Phòng TNCNNano), FE-SEM (EDS) (Viện Công nghệ Hoá học tại TP. Hồ Chí Minh), xác định hàm lượng bạc AAS-ICP (Trung tâm Dịch vụ và Phân tích Hoá lý)
36
Chương 3: KẾT QUẢ
&
37
3.1. CHẾ TẠO HẠT NANO BẠC
Tiến hành thực hiện phản ứng điều chế hạt nano bạc bằng cách cho AgNO3 vào
dung dịch trong suốt gồm ethylen glycol và PVP. Quan sát quá trình phản ứng trong lò vi sóng thấy có sự thay đổi màu của dung dịch, từ không màu sang màu vàng. Điều này chứng tỏ phản ứng hóa học chuyển hóa Ag+ thành Ag0 đã xảy ra.
Cơ chế của phản ứng được đề nghị như sau [31]:
Hình 3.1 : Sự biến đổi của dung dịch trong quá trình điều chế hạt nano bạc
Với sự phát triển của ngành hóa học xanh để giải quyết về những vấn đề ô nhiễm môi trường, các nhà khoa học đã thực hiện nhiều phản ứng trong lò vi sóng. Đây là một phương pháp gia nhiệt nhanh, cung cấp nhiệt đồng đều cho toàn bộ dung dịch phản ứng. Một số công trình [18] cũng sử dụng nhiệt vi sóng để chế tạo dung dịch keo nano bạc với ưu điểm là kích thước các hạt nano bạc nhỏ và tương đối đồng nhất. Đây cũng là lựa chọn của chúng tôi khi thực hiện chế tạo dung dịch keo nano bạc với tiền chất là hợp chất nitrat bạc.
3.1.1 Xác định sự hiện diện của hạt nano bạc trong dung dịch và thời gian phản ứng
3.1.1.1. Xác định sự hiện diện của hạt nano bạc trong dung dịch
Kết quả phổ UV-Vis của dung dịch (hình 3.2) cho thấy có một đỉnh hấp thu mạnh ở bước sóng 406 nm. Theo các tài liệu [37, 38, 39], khi tiến hành phân tích mẫu dung dịch nano bạc bằng phương pháp phổ UV-Vis, với kết quả nhận được có các đỉnh hấp thu trong khoảng từ 400nm đến 450nm thì có thể khẳng định rằng trong dung
38
dịch đó đã có sự hiện diện của hạt nano bạc. Như vậy, trong dung dịch chế tạo được kể trên đã có sự hiện diện của hạt nano bạc.
Hình 3.2 : Phổ UV-Vis của dung dịch nano bạc.
3.1.1.2. Ảnh hưởng của thời gian, chất bảo vệ, lượng AgNO3 đến quá trình phản ứng
Tiến hành điều chế dung dịch chứa hạt nano bạc với hàm lượng AgNO3 cao
(0,28gam) hoặc thấp (0,046gam), lượng PVP được chọn theo tỷ lệ 5
3
AgNO PVP
, PVP phải tan hoàn toàn trong 200 ml ethylen glycol trước khi thêm AgNO3 vào để tiến hành phản ứng.
Phản ứng được thực hiện trong lò vi sóng với công suất P=160W và quá trình điều chế được trình bày trong bảng 3.1.
39 Thí nghiệm P ( W) Thời gian (phút) Hàm lượng AgNO3(g) Thời gian nghỉ ( phút) 1a 160 4’30’’ 0,046 1’00’’ 1b 160 5’00’’ 0,046 1’00’’ 1c 160 5’30’’ 0,046 1’00’’ 1d 160 6’00’’ 0,046 1’00’’ 1e 160 12’00’’ 0,046 1’00’’ 2a 160 4’30’’ 0,28 1’00’’ 2b 160 5’00’’ 0,28 1’00’’ 2c 160 5’30’’ 0,28 1’00’’ 2d 160 6’00’’ 0,28 1’00’’ 2e 160 12’00’’ 0,28 1’00’’ 3a 160 6’00’’ 0,28 1’00’’ 3b 160 6’00’’ 0,28 1’00’’ 3c 160 6’00’’ 0,28 1’00’’ 4a 160 6’00’’ 0,046 1’00’’ 4b 160 6’00’’ 0,28 1’00’’ 5a 160 0 tháng 0,28 5b - 1 tháng 0,28 5c - 2 tháng 0,28 5d - 3 tháng 0,28 5e - 4 tháng 0,28 5f - 5 tháng 0,28
40
*Ảnh hưởng của thời gian phản ứng.
Hình 3.3 : Phổ UV-Vis của dung dịch nano bạc ứng với hàm lượng AgNO3 0,046g.
Thời gian t (phút) Độ hấp thu A
4,5 0,82 5,0 0,85 5,5 0,86 6 0,88 12 0,88
Bảng 3.2 : Giá trị độ hấp thu A theo thời gian t của dung dịch nano bạc ứng
41
Đồ thị 3.1 : Độ hấp thu A theo thời gian phản ứng t ứng với lượng AgNO3 0,046g
Nhận xét: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình phản ứng với lượng AgNO3 0,046g được trình bày trong hình 3.3, bảng 3.2 và đồ thị 3.1. Kết quả cho thấy độ hấp thu A tăng dần theo thời gian (từ 0,82 sau 4 phút tăng lên 0,88 sau 6 phút). Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian thêm 6 phút, độ hấp thu A vẫn không đổi (A=0,88), nghĩa là lượng hạt nano bạc không tăng nữa. Như vậy, thời gian để điều chế
hạt nano bạc với hàm lượng AgNO3 0,046g là 6 phút.
0.81 0.82 0.83 0.84 0.85 0.86 0.87 0.88 0.89 0 2 4 6 8 10 12 14 t (ph) A
42
Hình 3.4: Phổ UV-Vis của dung dịch nano bạc ứng với hàm lượng AgNO3 0,28g.
Thời gian ( phút) Độ hấp thu A
4,5 1,1 5,0 1,6 5.5 2,9 6 3,25 12 3,25
Bảng 3.3 : Giá trị độ hấp thu A theo thời gian t của dung dịch nano bạc ứng
43
Đồ thị 3.2 : Đồ thị độ hấp thu A theo thời gian phản ứng t ứng với hàm lượng AgNO3 0,28g
Nhận xét: Tương tự như với hàm lượng AgNO3 0,046g, kết quả nhận được trên hình 3.4, bảng 3.3 và đồ thị 3.2 cho thấy trong quá trình phản ứng điều chế hạt nano
bạc với lượng AgNO3 0,28g cũng cho độ hấp thu A tăng dần theo thời gian (từ 1,1
sau 4 phút tăng lên 3,25 sau 6 phút). Tuy nhiên với thời gian 6 phút tiếp theo, độ hấp thu A vẫn không đổi (A=3,25). Như vậy, thời gian để điều chế hạt nano bạc với hàm
lượng AgNO3 0,28g là 6 phút.
Ảnh hưởng của hàm lượng chất bảo vệ: Tiến hành điều chế dung dịch nano
bạc với thời gian 6 phút và công suất là 160 W ứng với hàm lượng AgNO3 0,28g và
hàm lượng chất bảo vệ PVP khác nhau. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 2 4 6 8 10 12 14 t (ph) A
44
Hình 3.5: Phổ UV-Vis của dung dịch nano bạc có
3 AgNO PVP khác nhau. 3 AgNO PVP Độ hấp thu A Bước sóng (nm) 4 3 411 10 3,2 410 16 3,6 408
Bảng 3.4: Giá trị độ hấp thu A theo thời gian t của dung dịch nano bạc ứng
với hàm lượng AgNO3 như nhau và lượng PVP khác nhau
Nhận xét: Kết quả trình bày trên hình 3.5 và bảng 3.4 cho thấy với cùng lượng
AgNO3 và ethylen glycol, khi tăng lượng PVP, độ hấp thu A tăng theo, đồng thời bước
sóng hấp thu giảm xuống, tức là lượng nano bạc tăng lên và kích thước hạt nhỏ hơn. Điều này có thể giải thích là khi lượng chất bảo vệ tăng, sự kết tụ của các hạt Ag0 sẽ giảm xuống, hạt nano bạc sẽ có kích thước nhỏ hơn, vì thế mà số lượng hạt nano bạc trong dung dịch có lượng PVP tăng lên, độ hấp thu A của dung dịch nano bạc sẽ cao hơn. Như vậy, trong quá trình điều chế nên sử dụng lượng PVP cao, tuy nhiên cần lựa
45
chọn phù hợp với lượng AgNO3 vì nếu lượng PVP quá nhiều khả năng hòa tan hết PVP trong ethylen glycol sẽ khó khăn.
Ảnh hưởng của hàm lượng AgNO3
Hình 3.6: Phổ UV-Vis của dung dịch nano bạc với hàm lượng AgNO3 khác nhau
Nhận xét: Với hàm lượng khác nhau của AgNO3 thì độ hấp thu A của phổ UV- Vis cũng khác nhau, tức là lượng nano bạc tạo ra cũng khác nhau. Tuy nhiên, xét về bước sóng hấp thu thì không khác biệt nhiều. Có thể kết luận rằng, tính chất của dung
dịch nano bạc ít phụ thuộc vào hàm lượng AgNO3 cao(0,28g) hay thấp(0,046g) trong
46
3.1.2. Xác định kích thước hạt nano bạc
3.1.2.1. Ảnh TEM của dung dịch nano bạc ứng với hàm lượng AgNO3 0,28g.
Hình 3.7: Ảnh TEM và đồ thị phân bố kích thước hạt nano bạc với hàm lượng AgNO3 0,28g.
Nhận xét : Dựa trên hình 3.7 cùng với đồ thị phân bố kích thước hạt, ta thấy rằng các hạt nano bạc chế tạo được có kích thước phân bố rộng trong khoảng từ 3nm đến 32 nm, chủ yếu tập trung trong khoảng 10 nm đến 13nm. Đồng thời các hạt chủ yếu có dạng hình cầu, đây là dạng cho hiệu quả kháng khuẩn cao nhất do có nhiều mặt tiếp xúc với vi khuẩn nhất.
47
3.1.2.2.Ảnh TEM của dung dịch nano bạc ứng với hàm lượng AgNO3 0,046g.
Hình 3.8: Ảnh TEM và đồ thị phân bố kích thước hạt nano bạc với hàm lượng AgNO3 0,046g.
Nhận xét: Ảnh TEM cùng với đồ thị phân bố kích thước hạt (hình 3.8) cho thấy các hạt nano bạc chế tạo được có dạng hình cầu, kích thước phân bố rộng trong khoảng từ 3nm đến 32 nm, chủ yếu tập trung trong khoảng 3nm đến 5nm. Tuy nhiên, có một phần không lớn các hạt có kích thước vào khoảng 20 nm. Các kết quả trên cho
thấy kích thước của các hạt nano bạc ứng với hàm lượng AgNO3 0,046g nhỏ hơn so
với kích thước của các hạt nano bạc ứng với hàm lượng AgNO3 0,28g.
Ảnh TEM cũng cho thấy các hạt nano bạc phân bố khá đều, đồng thời xuất hiện
các hạt nano bạc tương đối lớn, nguyên nhân chủ yếu là khi ion Ag+ bị khử về Ag0 thì
các nguyên tử Ag0 sẽ có khuynh hướng va chạm và kết tụ lại với nhau tạo thành hạt
nano bạc. Sự va chạm là ngẫu nhiên do đó mà chúng ta thấy rằng các hạt bạc tạo ra có kích thước nanomet không đồng đều và giàn trải từ 3nm đến 32 nm.
48
3.1.3.Xác định tính bền, ổn định của dung dịch nano bạc tạo thành.
Hình 3.9 : Dung dịch nano bạc dùng cho thí nghiệm khảo sát tính bền. Tính bền của dung dịch nano bạc chế tạo ra được đánh giá theo tiêu chí:
Dung dịch không bị đục, không có những biến đổi nhiều về tính chất lý hóa so với dung dịch ban đầu trong quá trình lưu mẫu. Điều đó có nghĩa là trên phổ UV-Vis không xuất hiện các đỉnh hấp thu khác thường.
Sự kết tụ các hạt nano bạc để tạo thành các hạt bạc có kích thước lớn hơn phải diễn ra chậm, tức là độ hấp thu của dung dịch nano bạc trên phổ UV-Vis theo thời gian