- Lò vi sóng (800 W, China, PTN Công Nghệ Nano ĐHQG TP.HCM)
- Cân phân tích (Max 210 gram, d = 0,1mg, model TE214S, Sartorius- Germany, PTN Công Nghệ Nano ĐHQG TP.HCM)
- Máy khuấy từ (China, PTN Công Nghệ Nano ĐHQG TP.HCM) - Một số dụng cụ như: becher, pipet, đũa khuấy...
2.1.3 Quy trình điều chế:
Gia nhiệt ở 800C khuấy trộn
phản ứng trong lò vi sóng khuấy
Sơ đồ 2.1: Qui trình điều chế dung dịch nano bạc
ETHYLEN GLYCOL PVP khuấy để PVP phân tán trong ETHYLEN GLYCOL Dung dịch ETHYLEN GLYCOL hoà tan PVP trong suốt
dung dịch có chứa hạt nano bạc
26
2.1.4 Thuyết minh quy trình: Hạt nano bạc được điều chế theo các bước sau. Bước 1: Phân tán và hoà tan PVP trong ethylen glycol.
Hình 2.1 : Khuấy phân tán và hoà tan PVP trong ethylen glycol.
Tiến hành cho PVP vào ethylen glycol,sau đó phân tán bằng cách khuấy đồng
thời gia nhiệt đến 800C để hoà tan PVP trong ethylen glycol cho đến khi dung dịch tạo
thành trong suốt.
Bước 2 : Tiến hành cho từ từ bạc nitrate tinh thể vào trong dung dịch trên và khuấy đều
Hình 2.2: Khuấy phân tán AgNO3 trong dung dịch PVP và ethylen glycol
Cho AgNO3 vào dung dịch ethylen glycol đã hoà tan PVP, khuấy phân tán
AgNO3 cho đến khi nào quan sát không thấy các gợn của tinh thể bạc thì ngừng khuấy,
27
Bước 3 : Phản ứng trong lò vi sóng.
Hình 2.3 : Thực hiện phản ứng trong lò vi sóng
Đưa dung dịch PVP hoà tan trong ethylen glycol có chứa AgNO3 đã phân tán
trong dung dịch vào lò vi sóng, chọn công suất của lò vi sóng, chọn thời gian thực hiện
phản ứng chuyển 0
Ag
Ag để chế tạo hạt nano bạc. Nhận diện sự hình thành của
hạt nano bạc bằng việc quan sát sự chuyển màu của dung dịch từ không màu sang màu vàng. Khi dung dịch có màu vàng tức là có phản ứng xảy ra và khi đó hạt nano bạc đã được tạo thành. Dung dịch nano bạc này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2. PHƢƠNG PHÁP CHẾ TẠO VẬT LIỆU PU TẨM Ag (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.1. Phương pháp ngâm tẩm:
Mẫu PU (40x40x6mm) được rửa bằng nước D.I, sấy khô tại nhiệt độ 60oC, sau
đó được ngâm vào dung dịch Ag nano (dung dịch Ag nano này đã được điều chế bằng phương pháp microwave) sau 10h, mẫu PU/Ag nano được lấy ra rửa bằng nước khử ion và sấy khô tại nhiệt độ 60oC.
2.2.2.Phương pháp in-situ: Mẫu PU (40x40x6mm) được rửa bằng nước khử ion, sấy
khô tại nhiệt độ 60oC, ngâm vào dung dịch keo bạc với các nồng độ khác nhau, đun
nhẹ và sau đó cho các mẫu này được đưa vào lò microwave trong 4 phút, sản phẩm được làm lạnh tại nhiệt độ phòng, sau 10h được lấy ra rửa sạch bằng nước khử ion và đem sấy khô tại nhiệt độ 60o
28
2.3. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA DUNG DỊCH KEO NANO BẠC VÀ VẬT LIỆU PU/Ag
2.3.1. Chủng vi sinh vật và nguồn nước 2.3.1.1. Chủng vi sinh
Chủng E.coli, Bacillus subtilis do Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên cung cấp
2.3.1.2. Nguồn nước
a. Nguồn nước cất (do Phòng Thí nghiệm Công Nghệ Nano cung cấp) b. Nguồn nước đầu nguồn (do Công Ty Thành Long cung cấp)
*Tiến hành lấy mẫu nước:
Công tác lấy mẫu và bảo quản mẫu đóng một vai trò quan trọng không thể coi thường và phải theo đúng kỹ thuật quy định. Mẫu nước có thể thay đổi thành phần trong khi chuyên chở vì ảnh hưởng của oxy trong không khí hoặc vì có những biến đổi hóa học do các vi sinh vật gây nên. Muốn đảm bảo chính xác kết quả phân tích cần phải tôn trọng kỹ thuật lấy mẫu và bảo quản mẫu.
*Bình đựng mẫu: Các dụng cụ chai lọ phải được khử trùng và phải có nút đậy kín. Trước khi dùng, bình và nút phải được ngâm trong dung dịch Sunfocromic từ 12- 24 giờ; rửa lại bằng nước sạch, để khô (đã tráng nước cất nhiều lần). Gói chai và đậy nút lại, đem sấy tiệt trùng trong lò sấy ở 108oC trong 30 phút hoặc hấp khử trùng ở
121oC trong 15 phút. Chai hay lọ lấy mẫu có dung tích 500ml. Không súc chai bằng
nước mẫu, không lấy đầy chai mà chỉ lấy lấy chai. Tránh để nước bắn tung tóe trên miệng chai hoặc phía ngoài chai trong lúc hứng nước vào chai cũng như không để ngón tay đụng vào miệng chai hoặc đụng vào phía bên trong nắp chai.
*Bảo quản mẫu nước: Các mẫu cần được phân tích càng sớm càng tốt ngay sau khi lấy mẫu xong. Bất kỳ trong trường hợp nào cũng không được để mẫu quá 24 giờ rồi mới phân tích. Các mẫu phải giữ ở nhiệt độ tương tự như nhiệt độ lúc lấy mẫu xét nghiệm. Điều này tương đối khó thực hiện, vì vậy, nếu mẫu xét nghiệm nào giữ quá 1- 2 giờ kể từ lúc lấy mẫu cho tới lúc đến phòng thí nghiệm thì phải giữ ở nhiệt độ thấp từ 4-6oC và trong bóng tối.
29
2.3.2.Hóa chất và nguyên vật liệu
*Dung dịch nano bạc được điều chế từ thí nghiệm trên.
*Tấm Polyurethane mút xốp do Công ty nệm Vạn Thành cung cấp
*Tấm Polyurethan mút xốp tẩm bạc .
*Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn:
- Môi trường Nutrient Agar
Cao thịt 3g
Pepton 5g
Agar 12g
Nước cất 1lít
pH = 7,2 ± 0,2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate)
Tryptose 20g
Lactose 5g
K2HPO4 2,75g
KH2PO4 2,75g
NaCl 5g
Sodium lauryl sulfat 0,1g
Nước cất đủ 1 l pH = 6,8 ± 0,2
- Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL)
Pepton 10g
Lactose 10g
Mật bò 20g Brilliant green 0,0133g Nước cất đủ 1 l
30
pH = 7,4 ± 0,2
- Môi trường lỏng E.coli (E.coli medium, canh EC)
Tryptose 20g Lactose 5g Muối mật 1,5g NaCl 5g K2HPO4 4g KH2PO4 1,5g Nước cất 1 lít pH = 6,9 ± 0,2
- Môi trường EMB
Pepton 10g Lactose 5g KH2PO4 2g Sucrose 5g Eosin Y 0,4g Methyl blue 0,07g Agar 13.5g Nước cất 1 l pH = 7,4 ± 0,2 - Canh Trypton Trypton 10g Nước cất 1 l pH= 6,9 ± 0,2 - Canh MR-VP Pepton 5g
31
Glucose 5g
Đệm phosphate 5g
Nước cất 1 l
pH= 7,5 ± 0,2
-Môi trường rắn Simmon Citrat Agar (Thạch Simon Citrate)
MgSO4 0.2g
Bromothymol blue 0.08g
Agar 15g Nước cất 1 l pH= 6,8 ± 0,2
* Các thuốc thử cho phản ứng sinh hoá:
-Thuốc thử Kovac’s -Thuốc thử Methyl Red
2.3.3. Thiết bị - dụng cụ 2.3.3.1.Thiết bị: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-Nồi hấp (Phòng TNCN Nano) -Tủ cấy (Phòng TNCN Nano) -Tủ ấm (Phòng TNCN Nano)
-Cân phân tích 4số, Sartorius (Phòng TNCN Nano)
2.3.3.2.Dụng cụ
Đĩa petri, que cấy, que trải, micropipet, ống nghiệm
2.3.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch nano bạc 2.3.4.1. Nguyên tắc
Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia và tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Trong phương pháp này cần phải pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào
32
thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh
dưỡng từ các nồng độ pha loãng sau khi đã nuôi cấy ở 37oC trong 24-48 giờ.
2.3.4.2.Phương pháp tiến hành
Cho 1ml dung dịch chứa nano bạc đã được pha loãng 2 lần vào ống nghiệm chứa
1ml dịch vi khuẩn (E. Coli hoặc Bacillus). Tiến hành mẫu đối chứng tương tự nhưng
thay dung dịch chứa nano bạc bằng nước cất vô trùng. Sau 20 phút, 5 giờ và 24 giờ lấy dịch vi khuẩn từ ống thí nghiệm và ống đối chứng được đem pha loãng đến các nồng độ 101
, 102, 103, 104 .Từ mỗi nồng độ lấy ra 100 µl đem trải lên đĩa môi trường
Nutrient Agar. Ủ ở 370C trong 24 giờ rồi đếm số khuẩn lạc thu được.
Tiến hành tương tự với các dung dịch nano bạc đã pha loãng 5 lần và 10 lần Cách tính kết quả: Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa. Dùng những đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 (theo FDA) để tính mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu
Mi (CFU/ml) = Ai * Di/V (2.1)
Trong đó Ai là số khuẩn lạc trung bình trong đĩa
Di là độ pha loãng
V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các
nồng độ pha loãng khác nhau.
Hiệu suất kháng khuẩn được xác định theo công thức sau:
η = ( N1-N2 )/ N1 * 100% (2.2)
Trong đó N1 là số khuẩn lạc trong đĩa đối chứng
N2 là số khuẩn lạc trong đĩa chứa chất kháng khuẩn
2.3.5. Khảo sát tính kháng khuẩn của màng Polyurethane có chứa nano bạc
2.3.5.1. Nguyên tắc (giống 2.3.4.1) 2.3.5.2.Phƣơng pháp tiến hành
Chuẩn bị 2 ống nghiệm vô trùng, cho vào mỗi ống 10ml dịch vi khuẩn
(E.Coli hoặc Bacillus subtilis). Cho vào ống nghiệm thứ nhất màng Polyurethane (kích (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thước 1cm x 9cm x 0,6cm) có chứa nano bạc (ống thí nghiệm). Với ống nghiệm thứ hai cho vào màng Polyurethane (kích thước 1cm x 9cm x 0,6cm) không chứa nano bạc (ống đối chứng). Sau khoảng thời gian 15 phút các màng được lấy ra cho vào ống
33
nghiệm vô trùng rồi vắt để thu lấy nước đã được xử lý. Nước này được được pha loãng đến các nồng độ 103, 104, 105. Từ mỗi nồng độ lấy 100 µl đem trải lên môi trường
Nutrient Agar. Ủ ở 370C trong 24 giờ rồi đếm số khuẩn lạc thu được
Cách tính kết quả theo phương trình (2.1) và (2.2)
2.3.6. Phương pháp phân tích Coliforms, E.coli từ nguồn nước do Công Ty Thành Long cung cấp trước và sau khi xử lý với tấm PU/Ag
Coliforms là nhóm trực khuẩn đường ruột gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí
hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37oC trong 24-
48 giờ. Do đó, môi trường được sử dụng để định lượng thường có chứa lactose để trắc nghiệm khả năng sinh hơi và có chất ức chế vi khuẩn Gram dương (muối mật).
E.coli thuộc nhóm Fecal Coliforms có khả năng thủy phân tryptophan trong môi
trường tạo ra indol, lên men đường glucose thật mạnh thành các sản phẩn acid rất bền, không sinh aceton, không sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất.
2.3.6.1. Nguyên tắc
Phương pháp MPN (phương pháp số có xác xuất cao nhất) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Phương pháp này dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau để xác định lượng vi sinh vật trong mẫu [9].
Phương pháp này thường được thực hiện trên mẫu ở vài nồng độ pha loãng khác nhau, trong đó phương pháp 3 nồng độ được dùng phổ biến nhất.
2.3.6.2.Phương pháp tiến hành a. Định lượng Coliforms
Mẫu nước được cho chảy qua hai tấm lọc Polyurethane riêng biệt: (1) tấm PU có chứa nano bạc (mẫu thí nghiệm) và (2) tấm PU không chứa nano bạc (mẫu đối chứng). Nước qua lọc được thu vào một bình chứa sạch.
Cấy 10ml mẫu nước vào ống chứa 10ml môi trường LSB đôi : 3 ống Cấy 1 ml mẫu nước vào ống chứa 10ml môi trường LSB đơn : 3 ống Cấy 0.1 ml mẫu nước vào ống chứa 10ml môi trường LSB đơn : 3 ống Ủ ở 37,0 ± 0,5o
C trong 24-48 giờ
34
Ủ ở 37,0 ± 0,5oC trong 24-48 giờ
Đếm số lượng ống (+) (sinh hơi) trong từng dãy
Tra bảng MPN tương ứng để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/100ml
b. Định lượng E.coli
Chọn các ống sinh từ môi trường LSB cấy sang môi trường canh EC. Ủ ở 44,5 ± 0,5oC trong 24 giờ
Chọn các ống sinh hơi cấy sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủ các đĩa này ở 37,0 ± 0.5oC trong 24-48 giờ
Các khuẩn lạc tròn, tâm đen, phẳng, có hoặc không có ánh kim là khuẩn lạc
E.coli giả định.
Chọn các khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1mm để kiểm tra xác định chắc chắn
E.coli theo nghiệm pháp IMViC (Indol, Methyl red, Voges Proskuer, Citrate) như sau:
*Phản ứng Indol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Một số vi khuẩn có khả năng sinh ra enzyme thủy phân tryptophan có trong môi trường nuôi cấy tạo thành indol. Chất này sẽ kết hợp với paradimethyl amino benzaldehyde có trong thuốc thử Kovac’s cho hợp chất màu đỏ.
Tiến hành: Dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường canh trypton. Ủ ở 37oC trong 24 giờ. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào, quan sát màu nếu xuất hiện vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường là phản ứng dương tính, ngược lại không xuất hiện vòng đỏ là phản ứng âm tính.
*Phản ứng Voges Proskauer
Một số vi khuẩn lên men đường glucose tạo thành chất trung hòa acetyl methyl carbinol hay aceton. Chất này bị oxy hóa trong môi trường kiềm rồi kết hợp với α- napthol cho màu đỏ hồng.
Tiến hành: Dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường
canh MR-VP. Ủ ở 37oC trong 24-48 giờ. Lấy 1ml canh khuẩn từ môi trường MR-VP
cho vào ống nghiệm vô trùng, nhỏ 0,6ml α – napthol và 0,2ml NaOH 40%, lắc đều và để 2 giờ, quan sát màu môi trường, nếu chuyển từ vàng sang đỏ hồng là phản ứng dương tính, nếu không đổi màu là phản ứng âm tính.
35 *Phản ứng Methyl-red
Phản ứng này dùng để phân biệt hai loại vi khuẩn và hình thức lên men đường glucose. Loại lên men đường glucose thật mạnh thành các sản phẩn acid rất bền làm cho pH của môi trường thay đổi MR (+). Loại lên men đường glucose thành các sản phẩm trung gian kém bền, các chất này biến thành chất trung hòa cuối cùng MR (-). Tiến hành: Ủ môi trường canh thang MR-VP trong 24-48 giờ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử methyl-red vào lắc đều và quan sát màu môi trường, nếu chuyển từ vàng sang đỏ là phản ứng dương tính, nếu không đổi màu là phản ứng âm tính.
*Phản ứng Simmon Citrate
Một số vi khuẩn sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất cho hoạt động trao
đổi chất. Khi citrate bị biến dưỡng đến giai đoạn cuối cùng là CO2 có sự mất cân bằng
về ion làm pH môi trường thay đổi sang kiềm, môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang xanh dương.
Tiến hành: Dùng que cấy vô trùng ria khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường thạch
nghiêng Simmon Citrate. Ủ ở 37oC trong 24-48 giờ. Môi trường có màu xanh dương là
phản ứng dương tính, còn màu xanh lá cây là phản ứng âm tính.
Các ống canh khuẩn mà lên men lactose, sinh hơi trong môi trường EC, tạo được khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB và cho kết quả thử nghiệm IMViC
++-- là ống có E.coli (+). Ghi nhận số ống nghiệm có E.coli (+) và tra bảng MPN để
tính ra mật độ E.coli trong mẫu.
2.3.7.Phương pháp phân tích hóa lý dung dịch nano bạc và vật liệu PU/Ag
Kích thước hạt nano bạc trong dung dịch keo được xác định bằng phương pháp xác định bước sóng hấp thu UV-Vis ((Phòng TNCNNano); phương pháp chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (ĐHBK TP.HCM).Các phương pháp phân tích cấu trúc vật liệu PU/Ag: Raman (Phòng TNCNNano), FE-SEM (EDS) (Viện Công nghệ Hoá học tại TP. Hồ Chí Minh), xác định hàm lượng bạc AAS-ICP (Trung tâm Dịch vụ và Phân tích Hoá lý)
36
Chương 3: KẾT QUẢ
&
37
3.1. CHẾ TẠO HẠT NANO BẠC
Tiến hành thực hiện phản ứng điều chế hạt nano bạc bằng cách cho AgNO3 vào
dung dịch trong suốt gồm ethylen glycol và PVP. Quan sát quá trình phản ứng trong lò vi sóng thấy có sự thay đổi màu của dung dịch, từ không màu sang màu vàng. Điều này chứng tỏ phản ứng hóa học chuyển hóa Ag+ thành Ag0 đã xảy ra.
Cơ chế của phản ứng được đề nghị như sau [31]:
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.1 : Sự biến đổi của dung dịch trong quá trình điều chế hạt nano bạc
Với sự phát triển của ngành hóa học xanh để giải quyết về những vấn đề ô nhiễm môi trường, các nhà khoa học đã thực hiện nhiều phản ứng trong lò vi sóng. Đây là một phương pháp gia nhiệt nhanh, cung cấp nhiệt đồng đều cho toàn bộ dung dịch phản ứng. Một số công trình [18] cũng sử dụng nhiệt vi sóng để chế tạo dung dịch keo nano bạc với ưu điểm là kích thước các hạt nano bạc nhỏ và tương đối đồng nhất. Đây cũng là lựa chọn của chúng tôi khi thực hiện chế tạo dung dịch keo nano bạc với