Những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh đã được thăm khám lâm sàng, khai thác về tiền sử gia đình, tiền sử bản thân bao gồm: tuổi, nghề nghiệp, các bệnh mãn tính (bệnh đái tháo đường, các bệnh về tuyến giáp…), các bệnh nhiễm trùng (viêm gan siêu vi trùng, các bệnh phụ khoa…), có tiếp xúc với các hóa chất độc, thuốc bảo vệ thực vật, có nghiện rượu, thuốc lá… và tiền sử về sản khoa….
2.2.2. Phƣơng pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotyp
2.2.2.1. Nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D.A (1965) có cải tiến [72].
Lấy 2ml máu tĩnh mạch cho vào ống li tâm đã được tráng bằng heparin đậy nút cao su kín và để vào phòng vô trùng.
Các bước nuôi cấy phải được thực hiện trong buồng cấy tế bào trong điều kiện vô trùng.
Dùng ống hút nhỏ giọt pipet Pasteur cho 6 – 8 giọt máu toàn phần vào túyp nuôi cấy có chứa 6ml môi trường nuôi cấy PB – max (F12, huyết thanh bê và PHA -
Phytohemagglutinin). Đậy nắp rồi để túyp nuôi cấy trong tủ ấm 37oC thời gian 72
giờ. Đến giờ thứ 70 bổ sung vào túyp nuôi cấy 1ml dung dịch Colcemid (2 giọt) nồng độ 1µg/1ml để tích lũy nhiều cụm kỳ giữa và thu hoạch tế bào ở giờ thứ 72.
2.2.2.2. Thu hoạch tế bào
- Túyp nuôi cấy được lấy ở tủ ấm 37oC được li tâm với tốc độ 800 – 1000 vòng/phút trong 10 phút.
- Loại bỏ dịch phía trên giữ lại phần cặn lắng chứa các tế bào, 30ml dung dịch
nhược trương KCl 0,075 M cho vào túyp nuôi cấy và để trong tủ ấm 37oC thời gian
khoảng 30 - 45 phút để phá vỡ màng tế bào.
- Li tâm, loại bỏ phần dịch phía trên, giữ lại phần cặn chứa nhân tế bào và các cụm NST ở kỳ giữa.
- Định hình tế bào bằng 10 ml dung dịch Carnoy (3 methanol : 1 acid acetic ) rồi li tâm loại bỏ dịch nổi ở phía trên (3 lần).
- Lần cuối cùng khi mẫu vật đã sạch, sau khi li tâm loại bỏ dịch ở phía trên, dùng ống hút nhỏ giọt pipet Pasteur hút lấy phần cặn chứa nhân tế bào và các cụm kỳ giữa và dàn đều lên lam kính sạch đã được để lạnh.
- Để tiêu bản khô tự nhiên rồi tiến hành nhuộm tiêu bản.
2.2.2.3. Phương pháp nhuộm tiêu bản bằng băng G theo Seabright M (1975) [80].
- Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm băng G theo phương pháp của Seabright. M (1975).
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất:
Dụng cụ: 5 cốc thủy tinh loại 100ml để đựng hóa chất và thuốc nhuộm, 2 cốc mỏ thủy tinh loại 500ml đựng nước rửa tiêu bản.
Hóa chất: NaCl (0,15N), Trypsin 1: 250 (Difco) KH2PO4, Na2HPO4.2H2O, Giemsa.
Cách pha hóa chất:
Dung dịch Trypsin mẹ 5%
Dung dịch Trypsin sử dụng: 1 ml dung dịch Trypsin mẹ 49 ml dung dịch NaCl 0,15N
Dung dịch đệm photphat KH2PO4 : 3,56g/1 lít
Dung dịch đệm photphat Na2HPO4.2H2O: 7,22g/1 lít H2O
Dung dịch Giemsa 5%: 2 ml dung dịch Giemsa mẹ
48 ml dung dịch đệm photphat pH = 6,8 Các bước được thực hiện trong điều kiện ở nhiệt độ phòng thí nghiệm:
Nhúng tiêu bản vào cốc đựng dung dịch NaCl 0,15N thời gian khoảng 25 – 30 giây.
Sau đó tiêu bản được cho vào một cốc khác đựng dung dịch Trypsin 0,15% (Difco 1: 250) thời gian 10 phút.
Rửa tiêu bản lặp lại 2 lần trong một cốc đựng dung dịch NaCl 0,15N.
Tiêu bản được nhuộm bằng thuốc nhuộm Giemsa 5% pH = 7 (15 - 20 phút). Tất cả các tiêu bản sau khi nhuộm xong được rửa trong 2 cốc đựng nước máy hoặc dưới vòi nước máy chảy nhẹ. Kiểm tra độ phân vùng dưới kính hiển vi, rồi sau đó để tiêu bản khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
2.2.2.4. Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotyp theo tiêu chuẩn ISCN (2009) [84]
Phân tích NST được thực hiện dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Mỗi cặp vợ chồng được phân tích NST:
- Với tiêu bản nhuộm băng G, chúng tôi phân tích 30 cụm kỳ giữa (trường hợp có nghi vấn có thể phân tích 100 cụm kì giữa) bao gồm: đếm số lượng NST và phân tích NST để phát hiện những rối loạn số lượng và cấu trúc NST. Trường hợp thể khảm có thể phân tích 100 cụm kỳ giữa.
- Tiêu chuẩn đánh giá: quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại x1000, tìm các cụm NST của tế bào đang phân chia ở kỳ giữa. Sau đó
chọn các cụm có các NST trải đều trên một diện tích và tạo thành một đám tròn tương đối đều đặn, các NST không chồng lên nhau có thể phân biệt được từng chiếc và đếm chính xác số lượng NST của từng cụm. Cũng trong các cụm đó, quan sát kỹ từng chiếc NST, phát hiện những bất thường về cấu trúc.
Lập karyotyp: Mỗi bệnh nhân được chọn 3 cụm kỳ giữa và lập karyotyp bằng hệ thống xếp NST tự động karyotyping với phần mềm Ikaros của hãng Carzei – Đức theo tiêu chuẩn ISCN – 2009 (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature)
Tổng hợp các số liệu đã quan sát rồi kết luận về số lượng và cấu trúc của bộ NST.
2.2.3. Xử lý số liệu
Các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh được thăm khám và xét nghiệm NST, lập karyotyp. Các số liệu được mã hóa nhập vào máy vi tính, xử lý và kiểm tra độ chính xác bằng các phương pháp thống kê Y học. Số liệu được xử lý và phân tích bằng chương trình Microsoft Excel 2007.
Các ứng dụng:
- Các hàm tính toán: SUM, AVERAGE, STDEV, MIN, MAX…. - Vẽ đồ thị và biểu đồ.
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Trong thời gian từ tháng 10 năm 2008 đến tháng 10 năm 2013, tổng số 1847 cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh được thăm khám lâm sàng tại bệnh viện Phụ sản Trung Ương, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Khoa sản bệnh viện Bạch Mai…đã gửi đến bộ môn Y sinh học – Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội yêu cầu xét nghiệm NST, phân tích và lập karyotyp, chúng tôi thu được kết quả như sau:
3.1. Biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và
sinh con bị dị tật bẩm sinh
Hình 4: Tỷ lệ rối loạn NST ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh
Trong số 1847 cặp vợ chồng (3694 trường hợp) có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh được xét nghiệm NST, phân tích và lập karyotyp chúng tôi đã phát hiện có 114 cặp vợ chồng (người vợ hoặc người chồng hoặc cả vợ và chồng) mang rối loạn NST (chiếm tỷ lệ 6.17%), 1733 cặp vợ chồng (chiếm tỷ lệ 93,83%) có karyotyp bình thường (46,XX hoặc 46,XY).
Khi nghiên cứu vai trò của rối loạn NST dẫn đến sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật một số tác giả đã nhật xét rằng: rối loạn NST làm giảm khả năng sinh sản ở cả nam giới và nữ giới. Bố mẹ mang rối loạn NST sẽ có nguy cơ cao sinh ra những đứa con dị tật. Rối loạn NST được công nhận là nguyên nhân chính dẫn đến sảy thai sớm. Ở các cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp có khả năng mang rối loạn NST cao hơn so với các cặp vợ chồng sinh sản bình thường [19,44,57,58,66,90]. Khoảng 7% các cặp vợ chồng sảy thai tự nhiên ít nhất 2 lần mà 1 trong 2 ngưởi mang rối loạn NST cân bằng. Theo Griebel CP. và cs [44], Blohm F và cs [19] cho biết có ít nhất 5% các cặp vợ chồng sảy thai tự nhiên được xét nghiệm có biểu hiện rối loạn NST, các tác giả cũng cho biết rối loạn NST là lý do gây sảy thai tự nhiên.
Nếu một trong hai vợ chồng mang rối loạn NST cân bằng thì các NST khó có thể ghép cặp và phân ly trong quá trình giảm phân hình thành giao tử. Kết quả là giao tử mang NST rối loạn khi thụ tinh sẽ tạo ra hợp tử có bộ NST không cân bằng. Sự rối loạn NST này sẽ làm chết phôi hoặc bào thai đang phát triển đây là lý do dẫn đến hiện tượng sảy thai tự nhiên liên tiếp. Tuy nhiên một vài trường hợp bào thai tiếp tục phát triển cho đến khi sinh thì mang dị tật bẩm sinh hoặc chậm phát triển trí tuệ [86].
Mặc dù đã có nhiều tác giả nghiên cứu về rối loạn NST ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của các tác giả cũng khác nhau. Dưới đây, chúng tôi xin trình bày thống kê kết quả của một số tác giả nghiên cứu trước so sánh với kết quả nghiên cứu của chúng tôi thể hiện ở bảng 1.
Bảng 1. Tỷ lệ rối loạn NST ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh của một số tác giả.
Tác giả Năm Số cặp vợ chồng Tỷ lệ rối loạn NST U Diedrich & CS [73] 1983 136 11% J.P. Fryns & CS [45] 1984 1068 5,5% Kroshikina VG & CS [40] 1984 202 2,5% Fryns JP & CS [24] 1998 1743 5,34% Jiang J. & CS [46] 2001 61 11,5% M. Azim [57] 2003 300 5,3% Dubey và cs [23] 2005 742 4,2%
Lakshmi Rao & CS [49] 2005 160 11,25%
Figen Celepa &CS [29] 2006 645 3,86%
Razied Dehghani Firoozabadi & CS [64] 2006 88 12,5%
Usha R. Dutta [75] 2010 1162 6,71%
Đặng Thị Nhâm [4] 2011 350 6,86%
Trương Thị Thuỳ Linh 2013 1847 6,17%
Bảng 1 cho thấy tỷ lệ rối loạn NST ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh ở các nghiên cứu là khác nhau, tỷ lệ này dao động từ 2% đến trên 12%. Theo chúng tôi, tỷ lệ này thay đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khác nhau về thời gian nghiên cứu, kích thước mẫu nghiên cứu và tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân của từng tác giả nghiên cứu và kĩ thuật nghiên cứu di truyền tế bào, nhưng cũng có thể phụ thuộc vào quần thể dân cư nghiên cứu khác nhau [87].
3.2. Biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể giữa ngƣời vợ và ngƣời chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con dị tật bẩm sinh
Tổng số 114 cặp vợ chồng (người vợ hoặc người chồng hoặc cả hai vợ chồng) có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh có biểu hiện rối loạn NST, trong đó có 67 người vợ (chiếm tỷ lệ 57,76%) và 49 người chồng (chiếm tỷ lệ 42,24%).
Hình 5: Tỷ lệ rối loạn NST giữa ngƣời vợ và ngƣời chồng ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh.
A.Lippman-Hand nhận xét rằng ở các cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp thì tỷ lệ nữ mang rối loạn NST chiếm tỷ lệ cao hơn nam giới [14]. Razied Dehghani Firoozabadi và cs phân tích NST của các cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp cũng cho thấy số phụ nữ mang rối loạn NST nhiều hơn đáng kể so với nam giới [75]. Một báo cáo khác của Franssen M T M và cs khi nghiên cứu về vai trò của rối loạn NST ở những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp đã kết luận rằng rối loạn NST ở người vợ cao hơn ở người chồng [37]. Nhưng các đột biến NST ở người chồng cũng đóng một vai trò nhất định trong nguyên nhân gây sảy thai [45].
Nhìn chung kết quả nghiên cứu của các tác giả trước đều chỉ ra rằng rối loạn NST phát hiện ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh thì rối loạn ở người vợ là cao hơn ở người chồng. Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng phát hiện trong số các cặp vợ chồng có biểu hiện rối loạn NST thì rối loạn ở người vợ là cao hơn ở người chồng. Như vậy, có thể thấy rằng tỷ lệ người vợ mang rối loạn NST cao hơn không chỉ trong các nghiên cứu chung mà còn thể hiện
ở nghiên cứu trên các cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con dị tật bẩm sinh. Điều này phản ánh một thực tế rối loạn NST ảnh hưởng lớn tới khả năng sinh sản của người vợ. Hơn nữa, ở người vợ mang rối loạn NST thì quá trình giảm phân vẫn xảy ra và tạo nên các giao tử bất thường dẫn tới sảy thai, thai lưu hoặc sinh con dị tật, còn ở người chồng mang rối loạn NST thường làm rối loạn quá trình giảm phân tạo tinh trùng vì vậy có thể dẫn tới vô sinh [57].
Trong nghiên cứu này chúng tôi còn phát hiện 2 cặp mang rối loạn NST xảy ra cả ở người chồng và người vợ. Cặp thứ nhất: người chồng mang rối loạn NST kiểu chuyển đoạn tương hỗ giữa NST số 1 và NST số 4 và có karyotyp là 46,XY,t(1;4)(q22;q21), người vợ mang chuyển đoạn hòa hợp tâm giữa NST số 13 và NST số 14 và có karyotyp là 45,XX,t(13q;14q). Cặp thứ 2: cả hai vợ chồng đều mang rối loạn NST kiểu lặp đoạn NST số 9, karyotyp của người chồng là 46,XY,dup(9)(q12), karyotyp của người vợ là 46,XX,dup(9)(q12). Trong một nghiên cứu của PR Scarbrough và cs (1984) cũng đã phát hiện cặp vợ chồng với tiền sử 2 lần sảy thai liên tiếp đều mang rối loạn NST. Tác giả cho rằng những cặp vợ chồng mà cả hai đều mang rối loạn NST rất hiếm gặp [78]. Nghiên cứu khác của Ahonadreza Zarifian và cs (2012) cũng đã phát hiện rối loạn NST ở cả hai vợ chồng, người chồng có karyotyp là 46,XY,t(6;16)(p12;q26), karyotyp của người vợ là 46,XX,t(6;16)(p12;q26). Như vậy, những cặp vợ chồng mà cả hai đều mang rối loạn NST là rất hiếm và là những trường hợp tư vấn rất phức tạp đòi hỏi phải có nhiều nghiên cứu sâu rộng hơn.
3.3. Biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và
sinh con bị dị tật bẩm sinh
Phân tích NST của 1847 cặp vợ chồng (3694 trường hợp) có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh chúng tôi phát hiện 116 trường hợp mang rối loạn NST trong đó 105 trường hợp (chiếm tỷ lệ 90,5%) có biểu hiện rối loạn về cấu trúc và 11 trường hợp (chiếm tỷ lệ 9,5%) rối loạn về số lượng.
Bảng 2. Sự phân bố các kiểu rối loạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh.
Các kiểu rối loạn NST Số lƣợng Tỷ lệ (%)
Rối loạn cấu trúc NST
Chuyển đoạn tƣơng hỗ 42 36,2
Chuyển đoạn hòa hợp tâm 25 21,55
Mất đoạn 9 7,76 Đảo đoạn 17 14,66 Lặp đoạn 7 6,05 Rối loạn phức tạp 5 4,3 Rối loạn số lƣợng NST NST giới tính 9 7,76 NST thƣờng 2 1,72 Tổng 116 100 Nhận xét
105 trường hợp rối loạn cấu trúc NST có:
42 trường hợp mang chuyển đoạn tương hỗ chiếm 36,2% tổng số rối
loạn NST
25 trường hợp mang chuyển đoạn hòa hợp tâm chiếm 21,55% tổng số
rối loạn.
Các trường hợp rối loạn khác bao gồm: mất đoạn, đảo đoạn và lặp đoạn. Đặc biệt, chúng tôi còn phát hiện có 5 trường hợp mang rối loạn phức tạp.
11 trường hợp có biểu hiện rối loạn về số lượng NST bao gồm 9 trường hợp rối loạn NST giới tính 2 trường hợp trisomi NST 21.
Bảng 3. Sự phân bố các rối loạn số lƣợng nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng
Rối loạn số lƣợng NST giới tính SL Rối loạn số lƣợng NST thƣờng SL
47,XXY[10%]/46,XY[90%] 45,X[5%]/46,XX[95%] 47,XXX[5%]/46,XX,[95%] 47,XXX[20%]//46,XX[80%] 47,XXX[10%] /46,XX[90%] 47,XXX[50%]/46,XX[50%] 1 1 1 1 2 1 47,XX,+21[2%]/46,XX[98%] 47,XX,+21[3%]/46,XX[97%] 1 1
9/11 cặp vợ chồng mang rối loạn NST về số lượng liên quan đến cặp NST giới tính và đều ở thể khảm với hai dòng tế bào trong đó dòng tế bào bị rối loạn NST chiếm tỉ lệ thấp. Điều này là phù hợp với thực tế vì những người mang rối loạn số lượng NST ở thể thuần thường mang dị tật kèm theo vô sinh. Những người mang rối loạn số lượng NST ở thể khảm với tỉ lệ dòng tế bào đột biến thấp có kiểu hình bình thường nhưng sẽ ảnh hưởng tới khả năng sinh sản dẫn tới sảy thai, thai lưu hoặc sinh con bị dị tật.
2/11 cặp vợ chồng có biểu hiện rối loạn số lượng NST liên quan đến cặp NST thường. Ở hai cặp vợ chồng này, cả 2 người vợ đều có biểu hiện rối loạn cặp NST