Hình 2. 2: Sơ đồ khối phương pháp nghiên cứu 2.2.2. QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA HỢP TỬ RONG MƠ GAI
Chọn những cây rong có gốc bám mang nhiều thỏi sinh sản đã thành thục (thỏi sinh sản dài 1,5 – 2 cm).
Rửa rong bằng nước biển (lọc bằng lưới lọc phytoplanton) để loại bỏ chất bẩn và vật bám.
Sau khi rửa, rong được giữ trong bể kính có sẵn nước biển, có sục khí.
Rong thành thục được kích thích phóng bào tử bằng phương pháp “kích thích khô”. Rong được phơi ra ngoài không khí ở điều kiện phòng thí nghiệm (30 – 32oC) với thời gian 15 phút. Tách những thỏi sinh sản đã được kích thích cho vào đĩa Petri có sẵn nước biển đã lọc, cho rong phóng trên đĩa Petri.
Ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình phóng và
thu bào tử rong mơ gai Theo dõi quá trình phát
triển của hợp tử rong mơ gai
Ảnh hưởng của giá thể lên mật độ bám và sự phát triển của rong mơ gai giai đoạn
hợp tử đến giai đoạn cây mầm (2 cm)
Ảnh hưởng của hàm lượng muối dinh dưỡng lên sự phát triển của rong mơ gai giai đoạn cây mầm
Thử nghiệm nhân giống rong mơ gai trong phòng
thí nghiệm
Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự phát triển của rong mơ gai giai đoạn cây mầm
Theo dõi quá trình phát triển của hợp tử qua kính hiển vi trong thời gian thí nghiệm. Dùng ống hút tách hợp tử rong, đưa lên kính hiển vi quan sát để xác định thời điểm phân cắt của hợp tử, quá trình hình thành các cơ quan (mầm, rễ, lá), chụp hình.
2.2.3. THÍ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ LÊN QUÁ TRÌNH PHÓNG VÀ THU BÀO TỬ RONG MƠ GAI PHÓNG VÀ THU BÀO TỬ RONG MƠ GAI
2.2.3.1. Ảnh hưởng của phương pháp phóng và thu bào tử lên số bào tử thu được và tỉ lệ thụ tinh được và tỉ lệ thụ tinh
Cây rong bố mẹ đã thành thục đem về phòng thí nghiệm được rửa sạch, giữ rong trong bể kính có thể tích 80 L, có sục khí. Chọn một cây bố, một cây mẹ có thỏi sinh sản đã thành thục (thỏi sinh sản dài 1,5 – 2 cm) để tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau.
Hình 2. 3: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng của phương pháp phóng và thu bào tử lên số bào tử thu được và tỉ lệ thụ tinh
Nghiệm thức 1: Không kích thích khô, không tác động cơ học
Chọn 90 thỏi cái, 90 thỏi đực bố trí đều vào 3 đĩa Petri có chứa nước biển đã lọc.
Nghiệm thức 2: Không kích thích khô, tác động cơ học
Chọn 90 thỏi cái, 90 thỏi đực bố trí đều vào 3 đĩa Petri có chứa nước biển đã lọc. Sau 24 giờ tiến hành thu bào tử bằng cách giũ nhẹ với chổi mềm để cho bào tử rơi ra.
Số bào tử thu được, tỉ lệ thụ tinh
Kết quả Tác động cơ học Không tác động cơ học Không tác động cơ học Tác động cơ học Không kích thích khô Kích thích khô
Nghiên cứu phương pháp phóng, thu bào tử
Nghiệm thức 3: Kích thích khô, không tác động cơ học
Rong bố mẹ được “kích thích khô” ở điều kiện phòng thí nghiệm (30 - 32oC) thời gian 15 phút, rồi chọn 90 thỏi cái và 90 thỏi đực chia đều vào 3 đĩa Petri có chứa nước biển đã lọc.
Nghiệm thức 4: Khích thích khô, tác động cơ học
Rong bố mẹ được “kích thích khô” ở điều kiện phòng thí nghiệm (30 - 32oC) thời gian 15 phút, rồi chọn 90 thỏi cái và 90 thỏi đực chia đều vào 3 đĩa Petri có chứa nước biển đã lọc.
Sau 24 giờ tiến hành thu bào tử bằng cách giũ nhẹ với chổi mềm để cho bào tử rơi ra. Sau đó cả 4 nghiệm thức được tiến hành như sau:
Lấy những thỏi rong ra khỏi đĩa Petri, đếm số bào tử, xác định tỉ lệ thụ tinh Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.2.3.2. Ảnh hưởng thời gian thu bào tử lên số bào tử, tỉ lệ thụ tinh
Cây rong bố mẹ đã thành thục đem về phòng thí nghiệm được rửa sạch, giữ rong trong bể kính có thể tích 80 L, có sục khí.
Tại 3 thời điểm sáng (7 - 8 h), trưa (11 - 12 h), chiều (4 - 5h), tiến hành “kích thích khô” với thời gian 15 phút ở điều kiện phòng thí nghiệm (30 – 32oC) rồi cho phóng và thu bào tử. Từ đó chọn 1 thời điểm thu bào tử để tiếp tục theo dõi số ngày thu được bào tử.
Hình 2. 4: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng thời gian thu bào tử lên số bào tử, tỉ lệ thụ tinh Rong bố, mẹ mang thỏi
sinh sản đã thành thục Rửa sạch, khử trùng
Nghiên cứu thời gian thu bào tử
Chiều Trưa
Sáng
Số bào tử thu được, tỉ lệ thụ tinh Xác định số ngày thu
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
2.2.4. THÍ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA GIÁ THỂ LÊN MẬT ĐỘ BÁM, SỰ PHÁT TRIỂN CỦA RONG MƠ GAI GIAI ĐOẠN HỢP TỬ ĐẾN CÂY MẦM PHÁT TRIỂN CỦA RONG MƠ GAI GIAI ĐOẠN HỢP TỬ ĐẾN CÂY MẦM
Rong bố mẹ có thỏi sinh sản đã thành thục tiến hành kích thích phóng bào tử bằng phương pháp “kích thích khô” ở điều kiện phòng thí nghiệm (30 – 32oC) với thời gian 15 phút. Đem những cây rong đã được kích thích khô cho vào bể kính có thể tích 80 L nước biển đã lọc. Sau khi rong phóng bào tử 24 h, vớt rong bố mẹ ra khỏi bể, thả 5 loại giá thể xuống đáy bể. Bào tử đã thụ tinh rồi lơ lửng trong tầng nước sau đó lắng xuống đáy bám ngẫu nhiên trên bề mặt các loại giá thể. Sau 1 ngày xác định mật độ hợp tử bám trên các loại giá thể, tiến hành bố trí đều các loại giá thể vào 3 bể (các loại giá thể được bố trí lặp lại 3 lần) có thể tích 80 L để tiếp tục ương nuôi.
Các loại giá thể được nghiên cứu là: 1) Dây thừng màu đen (nylon 50 % và cotton 50 %), 2) Dây thừng màu xanh (nylon 100 %), 3) Tấm Ximăng, 4) San hô, 5) Dây vải (cotton 100 %).
Hằng tuần thay toàn bộ nước trong bể và bón phân.
Theo dõi mật độ, sự phát triển, tỷ lệ sống của hợp tử tại ngày 10, 15, 20, 30, 50, 80, 110 ngày thí nghiệm.
Hình 2. 5: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng của giá thể lên mật độ bám, sự phát triển của rong mơ gai giai đoạn hợp tử đến cây mầm
Hợp tử rong Dây thừng đen Dây thừng xanh Xi măng San hô Vải Mật độ Tỷ lệ sống Sự phát triển Kết quả
2.2.5. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA RONG MƠ GIAI ĐOẠN CÂY MẦM CỦA RONG MƠ GIAI ĐOẠN CÂY MẦM
2.2.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng muối dinh dưỡng lên sự phát triển rong mơ gai giai đoạn cây mầm triển rong mơ gai giai đoạn cây mầm
a. Điều kiện thí nghiệm
Nhiệt độ: 27 - 30oC, độ mặn 30 – 32 ‰ Dinh dưỡng: KNO3: KH2PO4
Ánh sáng: 45 - 700 µmol photon/m2/s
b. Bố trí thí nghiệm
Rong giống được lấy từ các đợt sản xuất tại viện. Lựa chọn rong giống có chiều dài toàn thân đồng đều 2 mm. Bố trí ngẫu nhiên vào 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thể tích bể 100 L, thể tích nước là 80 L. Bể có lọc san hô và có dòng chảy liên tục bằng một máy bơm công suất 0,3 m3/giờ. Thay toàn bộ nước và bón phân 1 lần/ tuần.
Hình 2. 6: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng muối dinh dưỡng lên sự phát triển rong mơ gai giai đoạn cây mầm
Đo chiều dài cây mầm (15 ngày/lần) theo 4 nồng độ dinh dưỡng.
2.2.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng lên sự phát triển rong mơ gai giai đoạn cây mầm đoạn cây mầm
a. Điều kiện thí nghiệm
Rong giống NT 3: 12 mg/L KNO3: 1,2 mg/L KH2PO4 NT 2: 8 mg/L KNO3: 0,8 mg/L KH2PO4 NT 1: 4 mg/L KNO3: 0,4 KH2PO4 mg/L NT 4: 16 mg/L KNO3: 1,6 mg/L KH2PO4
Sự phát triển của cây mầm S. polycystum
- Nhiệt độ: 27 - 30oC, độ mặn 30 – 32 ‰.
- Dinh dưỡng sử dụng trong thí nghiệm: 4 mg/L KNO3: 0,4 mg/L KH2PO4 - Sử dụng lưới màu xanh và đen để tạo thành thiết bị giảm ánh sáng
b. Bố trí thí nghiệm
Rong giống được lấy từ các đợt sản xuất tại viện. Lựa chọn rong giống có chiều dài toàn thân đồng đều 2 mm. Bố trí ngẫu nhiên vào 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thể tích bể 100 L, thể tích nước là 80 L. Bể có lọc san hô và có dòng chảy liên tục bằng một máy bơm công suất 0,3 m3/giờ. Thay toàn bộ nước và bón phân 1 lần/ tuần.
Thí nghiệm tiến hành ở 4 cường độ ánh sáng như sau:
Nghiệm thức 1: Lưới xanh, đen: 90 ± 22 µ mol photon/m2/s =1/16 cường độ ánh sáng tự nhiên
Nghiệm thức 2: Lưới đen: 177 ± 25 µ mol photon/m2/s = 1/8 cường độ ánh sáng tự nhiên
Nghiệm thức 3: Lưới xanh: 355 ± 20 µ mol photon/m2/s = 1/4 cường độ ánh sáng tự nhiên
Nghiệm thức 4: Không lưới: 710 ± 33µ mol photon/m2/s =1/2 cường độ ánh sáng tự nhiên
Hình 2. 7: Nghiên cứu ảnh hưởng ánh sáng lên sự phát triển của rong mơ gai giai đoạn cây mầm
Đo chiều dài (15ngày/lần) theo 4 cường độ ánh sáng. Rong giống
Lưới xanh Lưới đen
Lưới xanh và đen Không lưới
Llướilưới Sự phát triển của cây mầm S. polycystum
2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.3.1. XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG Nhiệt độ: Đo bằng nhiệt kế Nhiệt độ: Đo bằng nhiệt kế
Độ mặn: Đo bằng khúc xạ kế Salinometer (Shibuya – Japan)
Cường độ ánh sáng được xác định bằng sensor hình cầu (Li-193 SA) 2.3.2. XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ SINH HỌC
Xác định số lượng bào tử phóng thích
- Phương pháp đếm bào tử là:
+ Pha loãng thể tích – đối với trường hợp bào tử nhiều.
+ Nếu bào tử ít ta có thể đếm trực tiếp mà không cần phải pha loãng
Tổng số trứng
Số trứng đã phóng và thu được = (bào tử/thỏi) n (thỏi)
Xác định tỷ lệ thụ tinh
Sau 24 giờ cho phóng bào tử, tiến hành đếm ngẫu nhiên 100 trứng, đếm số trứng đã thụ tinh. Tỉ lệ thụ tinh bằng = số trứng thụ tinh (%).
- Kích thước hợp tử rong: Được đo bằng thước trên kính hiển vi - Kích thước cây mầm được đo bằng thước kẻ, chia vạch 1mm.
2.4. PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
Số liệu kết quả thí nghiệm được xử lý và phân tích bằng phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Microsoft Excel và phần mềm SPSS 16.0.
CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA HỢP TỬ RONG MƠ GAI
Thỏi sinh sản cái và đực Trứng chưa thụ tinh Trứng thụ tinh sau 1 giờ
Lần phân cắt đầu tiên Phân cắt lần 2 Phân cắt lần 3
Phôi đa bào Hợp tử có đế bám Hợp tử xuất hiện rễ
Cây mầm sau 10 ngày Cây mầm sau 12 ngày Cây mầm sau 60 ngày Hình 3. 1 Quá trình phát triển từ hợp tử đến cây mầm 2 mm (60 ngày)
Qua theo dõi dưới kính hiển vi cho thấy, sau 2 giờ thụ tinh, hợp tử bắt đầu phân cắt. Lần thứ nhất phân cắt làm hai phần bằng nhau, lầu thứ hai phân cắt theo mặt phẳng về một bên và song song với lần đầu thành 3 tế bào kích thước khác nhau, tế bào nhỏ ở mép ngoài mà sau này hình thành rễ. Lần phân cắt thứ ba vuông góc với lần phân cắt thứ nhất và theo phía ngược lại với mặt phân cắt thứ hai thành 4 tế bào. Sau đó là những mặt phân cắt thẳng góc với mặt phẳng phân cắt thứ nhất để hình thành phôi đa bào có hình bầu dục phân biệt được đỉnh và gốc. Sau 72 giờ, hợp tử đã phát triển rễ giả hình sợi gồm một dãy tế bào, phát triển theo hướng phóng xạ với số lượng từ 10 - 25 rễ giả. Sau khi mọc rễ thì hợp tử phát triển chồi đỉnh vào ngày thứ 5. Ngày thứ 10, phát triển các chồi bên dạng phiến dẹp. Ngày thứ 150 - 180, cây mầm phát triển nhánh bên (Hình 3. 1, Bảng 3. 1).
Bảng 3. 1: Tóm tắt quá trình phát triển hợp tử rong mơ gai
Thời gian Kích thước Đặc điểm hình thái
Thụ tinh (0 giờ) Sau 2 giờ Sau 24 giờ Sau 72 giờ Ngày thứ 5 Ngày thứ 10 Sau 2 tháng 125 – 140 µm 130 – 150 µm 150 – 200 µm 200 – 300 µm 300 – 500 µm 1,5 – 2 mm Phân cắt lần 1 Hình thành đĩa bám Hình thành rễ giả Phát triển chồi đỉnh Phát triển các chồi bên
3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ LÊN QUÁ TRÌNH PHÓNG BÀO TỬ RONG MƠ GAI RONG MƠ GAI
3.2.1. ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÓNG VÀ THU BÀO TỬ LÊN SỐ LƯỢNG BÀO TỬ THU ĐƯỢC, TỶ LỆ THỤ TINH SỐ LƯỢNG BÀO TỬ THU ĐƯỢC, TỶ LỆ THỤ TINH
3.2.1.1. Số lượng bào tử thu được ở các phương pháp cho phóng, thu khác nhau
Qua thí nghiệm ta thấy, số lượng bào tử thu được khác nhau ở các phương pháp phóng và thu khác nhau. Khi không được “kích thích khô” thì số bào tử thu được rất thấp, nếu không được “kích thích khô”, lúc thu bào tử không có tác động cơ học số bào tử thu được là thấp nhất (53 ± 2,8 bào tử/thỏi) so với 3 nghiệm thức còn lại, ở nghiệm thức không kích thích khô nhưng trong quá trình tiến hành thu bào tử có sự tác động cơ học thì số bào tử thu được tăng lên (66 ± 1,0 bào tử/thỏi) và không khác nhau so với với nghiệm thức kích thích rong phóng bào tử bằng phương pháp “kích thích khô” nhưng lúc thu bào tử không có sự tác động cơ học (65 ± 5,0 bào tử/thỏi). Nghiệm thức đồng thời có “kích thích khô” và khi thu bào tử có tác động cơ học thì kết quả thu được số bào tử là cao nhất (91 ± 2,1 bào tử/thỏi) (p<0,05) (Hình 3. 2).
c b b a 30 40 50 60 70 80 90 100 không KT khô, không TĐ cơ học không KT khô, TĐ cơ hoc KT khô, không TĐ cơ học KT khô, TĐ cơ học Số bào tử Phương pháp phóng và thu bào tử Số bào tử
Hình 3. 2: Số bào tử ở các phương pháp cho phóng và thu khác nhau Các giá trị có chữ cái trên đồ thị khác nhau thì khác nhau (p <0,05)
Như vậy, việc “kích thích khô” để rong phóng bào tử nhưng lúc thu bào tử không có tác động cơ học thì hiệu quả thu được bào tử không cao, điều này có thể hiểu
túi bào tử sau khi có sự kích thích khô đã phóng bào tử ra, nhưng bào tử còn bám trên đế cái, nhờ có tác động cơ học thì bào tử mới được rớt ra ngoài. Đối với phương pháp này đã thu được bào tử ít hơn so với nghiên cứu của Rangaiah và cộng sự (2012) trên rong S. ilicifolium khi rong được “kích thích khô” trong phòng thí nghiệm 15 phút (32 ± 2oC, độ ẩm 62 - 67%) lượng bào tử phóng ra là cao nhất (5.1033 bào tử/thỏi) tại thời điểm bắt đầu cho rong vào môi trường nước. Khi “kích thích khô” rong ở điều kiện tự nhiên (34oC ± 2oC, độ ẩm 58 - 63%) 15 phút thì bào tử phóng ra là nhiều nhất 8.103 bào tử/ thỏi tại thời gian bắt đầu cho rong vào môi trường nước, và lượng bào tử giảm đột ngột ở thời gian sau đó, nếu thời gian “kích thích khô” là 25 phút thì lượng bào tử phóng ra là thấp nhất, thời gian kích thích lâu hơn thì rong ngừng phóng [25]. Còn Soniya Sukumaran và N. Kaliaperumal (2000) đã nghiên cứu trên rong S. wightii
((Greville) J. Agardh và kết luận: Ở điều kiện phòng (30 ± 2oC, độ ẩm 48 - 61%) không được “kích thích khô” trước khi phóng thì cho sản lượng cực đại (45 bào tử/ thỏi) và cao hơn so với rong được “kích thích khô” [29].
3.2.1.2. Tỉ lệ thụ tinh ở các phương pháp phóng, thu bào tử khác nhau
a a a a 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 không KT khô, không TĐ cơ học không KT khô, TĐ cơ hoc KT khô, không TĐ cơ học KT khô, TĐ cơ học Tỉ lệ (%) Phương pháp phóng và thu bào tử Tỉ lệ thụ tinh
Hình 3. 3: Tỉ lệ thụ tinh ở các phương pháp cho phóng và thu khác nhau Các giá trị có chữ cái trên đồ thị khác nhau thì khác nhau (p <0,05)
Nhìn chung, tỉ lệ thụ tinh ở các phương pháp phóng, thu bào tử tương đối thấp (77,3 % - 79,3 %). Ở các phương pháp phóng và thu không có kích thích khô, không tác động cơ học cao