Số liệu báo cáo là trung bình của 3 lần phân tích. Kết quả đƣợc phân tích thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel và SPSS 16.0. Giá trị của p < 0,05 đƣợc xem là có ý nghĩa về mặt thống kê.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác ịnh thành phần hóa học cơ bản của nang mực
Nang mực sau khi thu mua tại một số cơ sở chế biến thuộc tỉnh Kiên Giang đƣợc vận chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản ở -20oC đến khi tiến hành thí nghiệm. Kết quả phân tích thành phần hóa học ban đầu của nang mực đƣợc thể hiện trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản cơ bản của nang mực
Chỉ tiêu phân tích Kết quả phân tích
Độ ẩm (%) 12,2 ± 0,12
Hàm lƣợng khoáng* (%) 2,4 ± 0,05 Hàm lƣợng protein* (%) 7,3 ± 0,18
Hàm lƣợng lipid* (%) 3,1 ± 0,15
Hàm lƣợng chitin* (%) 85,8 ± 0,25 *: Tính theo trọng lƣợng khô tuyệt đối
Kết quả phân tích cho thấy nang mực chứa thành phần chính là β-chitin (85,8%), ngoài ra còn có chứa một lƣợng protein (7,3%), khoáng (2,4%) và lipid (3,1%). Số liệu phân tích tƣơng ứng với kết quả nghiên cứu của No và Meyers, 1997 với hàm lƣợng β-chitin, protein và khoáng trong nang mực đạt lần lƣợt là 80%; 8,3% và 1,2% [19]. Tuy nhiên, kết quả công bố của Cortizo, S. và đồng tác giả (2008) [21], Kurita và đồng tác giả (1993) có sự chênh lệch, theo các tác giả trên thì hàm lƣợng khoáng chỉ chiếm khoảng 1%, 30 – 40% β-chitin [14]. Theo Rhazi, M. (2000), hàm lƣợng β-chitin trong nang mực chiếm khoảng 40% [20], kết quả này chênh lệch khá lớn so với hàm lƣợng β-chitin phân tích từ nang mực thu nhận tại Kiên Giang.
Kết phân tích cho thấy, hàm lƣợng β-chitin trong nang mực cao (85,8%) do đó cần tiến hành các nghiên cứu thu nhận. Tuy nhiên nang mực chiếm một lƣợng protein và khoáng đáng kể do vậy cần phải nghiên cứu chế độ khử protein, khử khoáng thích hợp để thu nhận β-chitin.
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng NaOH ến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin trong quá trình khử protein
Nang mực đƣợc cắt nhỏ với chiều dài 3 cm, sau đó đƣợc xử lý NaOH ở nhiệt độ phòng trong thời gian 12 giờ, tỷ lệ NaOH/nang mực là 5/1(v/w) ở các nồng độ 1, 2, 3, 4, 5% (v/v). Sau quá trình khử protein nang mực tiếp tục đƣợc khử khoáng với HCl 0,5% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Kết quả phân tích hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin đƣợc thể hiện trong Hình 3.1.
d c b a a 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 H àm lƣợn g pr ot ei n còn l ại c ủa β- chi ti n (% ) Nồng NaOH (%)
Theo kết quả phân tích ở Hình 3.1, hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin tỷ lệ nghịch với nồng độ NaOH, điều này hoàn toàn phù hợp với nhận định của Trung và cộng sự 2010 khi tăng nồng độ NaOH thì khả năng thủy phân tăng cao do đó hàm lƣợng protein còn lại thấp [4].
Khi xử lý NaOH với nồng độ 1, 2, 3 % hàm lƣợng protein còn lại tƣơng đối cao (>1%) Hàm lƣợng protein trong β-chitin khi xử lý NaOH 1, 2, 3 % lần lƣợt là 5,2%; 3,7%; 1,5%. Tuy nhiên khi tăng nồng độ NaOH lên 4, 5% hàm lƣợng protein trong β-chitin giảm mạnh và giá trị protein thu đƣợc khi xử lý NaOH 4, 5% lần lƣợt là 0,9%; 0,6%.
Nhƣ vậy, hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin khi xử lý NaOH 5% là thấp nhất (0,6%) tuy nhiên khi phân tích dữ liệu thống kê với phép toán tukey thì cho thấy không có sự khác biệt về hàm lƣợng protein ở công thức xử lý NaOH 4% và NaOH 5% do đó công thức xử lý NaOH 4% đƣợc cho là phù hợp và đƣợc sử dụng làm dẫn liệu cho các thí nghiệm về sau.
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt khử protein nang mực ến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin
Nang mực đƣợc xử lý với NaOH 4% trong thời gian 12 giờ, tỷ lệ NaOH/nang mực là 5/1 (v/w) với nhiệt độ 70oC, 80oC, 90oC để xem xét ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin. Kết quả phân tích hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin đƣợc thể hiện ở Hình 3.2.
c b a 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 70 80 90 H àm lƣợ ng p ro te in c òn lạ i tr on g β- c h iti n (% ) Nhiệt (oC)
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt ến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin
Nhiệt độ có ảnh hƣởng lớn đến quá trình thủy phân protein, theo Trung và cộng sự 2010, ở nhiệt độ thƣờng, quá trình tách protein diễn ra chậm, thời gian thủy phân từ 1 đến vài ngày. Khi nâng nhiệt độ xử lí, quá trình tách protein diễn ra nhanh do vậy có thể rút ngắn thời gian xử lý [4].
Kết quả Hình 3.2 cho thấy, nhiệt độ càng tăng thì hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin càng thấp điều này có thể do nhiệt độ cao đã xúc tác mạnh phản ứng thủy phân protein của NaOH, hơn nữa khi nhiệt độ cao thì quá trình đứt gãy các liên kết peptid xảy ra cũng dễ dàng hơn do đó quá trình tách protein ra khỏi nang mực diễn ra nhanh và mạnh hơn.
Kết quả Hình 3.2 cho thấy, hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin cao nhất khi xử lý ở 70oC (Hàm lƣợng protein còn lại là 1,05%) và thấp nhất khi xử lý ở 90oC (hàm lƣợng protein còn lại là 0,43%). Ở nhiệt độ xử lý 80oC, hàm lƣợng protein còn lại trong chitin là 0,57%.
Hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin khi xử lý ở 70, 80, 90o
C có sự khác nhau về mặt thống kê khi phân tích tukey tuy nhiên với yêu cầu của chitin thƣơng mại (hàm lƣợng protein <1%) thì việc xử lý ở 80oC là phù hợp, hàm lƣợng protien
khi xử lý ở nhiệt độ này là 0,57% và kết quả này đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm về sau.
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian xử lý NaOH ến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin.
Nang mực đƣợc xử lý với NaOH 4%, nhiệt độ 80oC, tỷ lệ NaOH/nang mực là 5/1 (v/w) trong thời gian 4, 8, 12, 16, 20 giờ để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian xử lý NaOH đến hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin. Kết quả phân tích hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin đƣợc thể hiện ở Hình 3.3.
e d c b a 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 4 8 12 16 20 H àm lƣợn g prot ei n còn l ại của β - chi ti n (% ) Thời gian (h)
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian ến hàm lƣợng protein còn lại của chitin
Từ kết quả phân tích trên ta thấy khi kéo dài thời gian xử lí hàm lƣợng protein giảm dần vì thời gian càng dài quá trình tách protein diễn ra càng mạnh [4].
Sau 4h và 8h xử lí, hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin còn cao >1%, sau 12h, 16h, 20h xử lí hàm lƣợng protein còn lại <1%, nhƣ vậy sau 12h, 16h, 20h xử lí đều thu đƣợc chitin đảm bảo hàm lƣợng protein còn lại <1%, để thuận lợi và tiết kiệm thời gian xử lí ta chọn 12h để khử protein vì thời gian dài sẽ làm cắt mạch sản phẩm chitin [4].
3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng HCl và thời gian khử khoáng ến hàm lƣợng khoáng còn lại của β-chitin
Mẫu sau khi xử lý NaOH 4%, trong thời gian 12 giờ với nhiệt độ 80C, đƣợc rửa trung tính và tiến hành khử khoáng với HCl 0; 0,1; 0,25; 0;5; 1% trong thời gian 2; 4; 6; 8 giờ ở nhiệt độ phòng. Kết quả phân tích hàm lƣợng khoáng còn lại trong chitin đƣợc thể hiện trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lƣợng khoáng còn lại trong β-chitin khi khử khoáng ở các iều kiện khác nhau
Thời gian Hàm lƣợng khoáng HCl (%)
(giờ) HCl 0% HCl 0,1% HCl 0,25% HCl 0,5% HCl 1% 0 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 2 1,4 1,2 1,07 0,25 0,2 4 1,4 1,1 0,94 0,1 0,05 6 1,4 0,95 0,95 0,07 ND 8 1,4 0,9 0,88 0,04 ND Ghi chú: ND: None Detect
Theo kết quả phân tích (Bảng 3.2) nang mực đã mất một lƣợng khoáng đáng kể (khoảng 50%) sau quá trình khử protein, hàm lƣợng khoáng còn lại sau quá trình khử protein bằng NaOH 4% đạt 1,4%, kết quả này phù hợp với ghi nhận của Trung và cộng sự (2010), theo tác giả chitin thƣờng liên kết với protein và khoáng do đó quá trình khử protein luôn đi kèm với quá trình loại một phần khoáng.
Kết quả Bảng 3.2 cũng cho thấy, Nồng độ HCl và thời gian có ảnh hƣởng đến hiệu suất của quá trình khử khoáng.
Xét về mặt thời gian, quá trình khử khoáng diễn ra mạnh trong 2 giờ đầu, Hàm lƣợng khoáng còn lại tại thời điểm 2 giờ sau khi xử lý với HCl 0,1; 0,25; 0,5; 1% đạt tƣơng ứng là: 1,2; 1,07; 0,25; 0,2%. Kết quả này phù hợp với nhận định của Trung và cộng sự (2010) khi cho rằng tốc độ phản ứng của quá trình khử khoáng diễn ra rất nhanh ở giai đoạn đầu (trong vòng 30 phút) với hàm lƣợng khoáng giảm đến 90%, sau đó quá trình diễn ra rất chậm. Kết quả tƣơng tự cũng đƣợc ghi nhận trong nghiên cứu của Rodrigo L. Lavall và đồng tác giả (2007) khi nghiên cứu trên đối tƣợng xƣơng mực Loligo sp.. Theo Rodrigo, L. hàm lƣợng khoáng còn lại trong -chitin phụ thuộc vào điều kiện khử khoáng, với mẫu khử khoáng bằng HCl 0,55M trong thời gian 2 giờ hàm lƣợng khoáng còn lại là 0,5 [4], [21].
Xét về mặt nồng độ, nồng độ HCl càng cao thì khả năng khử khoáng càng mạnh. Đối với những mẫu sử dụng HCl 0,5; 1% thì chỉ cần 2 giờ khử thì hàm lƣợng khoáng còn lại trong chitin đã thấp hơn 1%, đối với mẫu dùng HCl 0,1% và HCl 0,25% thì cần đến 4 giờ hoặc 6 giờ khử thì chitin mới đạt đƣợc yêu cầu về hàm lƣợng khoáng (<1%).
Nhƣ vậy việc sử dụng HCl có nồng độ cao sẽ rút ngắn đƣợc thời gian xử lý tuy nhiên Theo Trung và công sự (2010) việc xử lý HCl có ảnh hƣởng lớn đến trọng lƣợng phân tử trung bình của chitin từ đó sẽ ảnh hƣởng đến các đặc tính sinh học của chitin và dẫn xuất của chitin là chitosan do vậy tùy thuộc vào mục đích của việc ứng dụng chitin chitosan mà chế độ khử khoáng sẽ khác nhau [4]. Với kết quả nghiên cứu trên, để rút ngắn thời gian xử lý thì nồng độ HCl 0,5%, thời gian 2 giờ đƣợc lựa chọn để ứng dụng sản xuất β-chitin.
3.6. Kết quả ánh giá chất lƣợng của chitin
Dựa vào những kết quả nghiên cứu ở trên, β-chitin đƣợc sản xuất theo sơ đồ Hình 3.4 để đánh giá chất lƣợng. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu chất lƣợng của β -chitin đƣợc thể hiện trong Bảng 3.3.
Hình 3.4. Sơ ồ sản xuất β-chitin
Nang mực đƣợc xử lý NaOH với nồng độ 4%, nhiệt độ 80oC, thời gian 12h sau đó đƣợc tiếp tục khử khoáng với HCl 0,5%, thời gian 2 giờ ở nhiệt độ phòng để sản xuất β-chitin. Kết quả phân tích chất lƣợng của β-chitin đƣợc thể hiện trong Bảng 3.3. Hình 3.5. β-chitin Khử khoáng (HCl 0,5% ở nhiệt độ phòng/ 2h, tỉ lệ HCl/nang mực là 5:1) Rửa trung tính β-chitin Rửa trung tính
Khử protein ( NaOH 4%/ 80oC/ 12h, tỉ lệ NaOH/ nang mực là 5:1(v/w))
Bảng 3. 3. Chỉ tiêu chất lƣợng của β-chitin Chỉ tiêu chất lƣợng Kết quả phân tích
Màu sắc Trắng, sáng
Hàm lƣợng ẩm (%) 10,1 ± 0,13
Hàm lƣợng protein (%) 0,4 ± 0,02 Hàm lƣợng khoáng (%) 0,22 ± 0,03
Độ deacetyl (%) 20,7 ± 1,56
Sau khi xác định đƣợc chế độ khử protein, khử khoáng thích hợp, thu đƣợc chitin và kết quả phân tích các chỉ tiêu của β-chitin nhƣ trên (Bảng 3.3). Kết quả phân tích cho thấy β-chitin có hàm lƣợng protein đạt 0,4%, hàm lƣợng khoáng đạt 0,22%, đáp ứng yêu cầu của chitosan công nghiệp [4].
3.7. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng NaOH ến chất lƣợng của chitosan
Chitin đƣợc xử lí bằng NaOH với các nồng độ 20, 30, 40, 50, 60%, tỉ lệ NaOH/ β-chitin là 5:1(v/w), ở 90o
C trong 12h, để xem xét ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến độ deacet của chitosan.Kết quả phân tích đƣợc trình bày ở Hình 3.6.
a b c d e 0 20 40 60 80 100 20 30 40 50 60 D D ( % ) Nồng NaOH ( %)
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng NaOH ến deacetyl của chitosan
Theo kết quả phân tích (Hình 3.6), nồng độ NaOH tỷ lệ thuận với độ deacetyl. Khi xử lí bằng NaOH 20%, 30%, 40% thu đƣợc chitosan có DD thấp (<70%), chƣa đảm bảo chất lƣợng của chitosan thƣơng mại ( Cho và cộng sự, 1998) điều này có thể do nồng độ kiềm thấp không đủ để tách nhóm acetyl ra khỏi chitin, sản phẩm chitosan sẽ không tan hoặc tan không hoàn toàn [4]. Tuy nhiên kết quả phân tích này có sự chênh lệch so với nghiên cứu của Entsar S. Abdou và đồng tác giả (2008), theo nhóm tác giả này khi sử dụng NaOH từ 30% ở nhiệt độ 121oC thì DD > 90% điều này có thể do điều kiện deactyl.
Khi xử lí bằng NaOH từ 50, 60% thu đƣợc chitosan có DD lần lƣợt là 87, 93%, kết quả có sự tƣơng đồng so với nghiên cứu của Jooyeoun Jung và Yanyun Zhao (2011) [12], theo tác giả này khi sử dụng phƣơng pháp Kurita, xử lí ở điều kiện 90oC, NaOH 40% hoặc 50% trong 4h thì DD >90% .
Từ kết quả phân tích trên cho thấy việc xử lí bằng NaOH 50% hoặc 60% trong thời gian 8h ở nhiệt độ 90o
C sẽ thu đƣợc chitosan có DD > 85%, đảm bảo yêu cầu về chất lƣợng chitosan thƣơng mại (Cho và cộng sự, 1998) do vậy để hạn chế việc sử dụng hóa chất thì NaOH 50% đƣợc lựa chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo [4].
3.8. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt ến deacetyl của chitosan
Chitin đã rửa sạch, phơi khô, ngâm trong NaOH 50%, tỉ lệ NaOH/ β-chitin là 5v/w), ở nhiệt độ 60, 70, 80, 90oC trong 12h. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ deacetyl của chitosan đƣợc trình bày ở Hình 3.7.
a b c d 0 20 40 60 80 100 60 70 80 90 DD ( % ) Nhiệt (0C)
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt ến DD của chitosan
Kết quả Hình 3.7 cho thấy, nhiệt độ có ảnh hƣởng đến độ deacetyl của chitosan, độ deacetyl của chitosan tăng dần theo chiều tăng của nhiệt độ điều này có thể do nhiệt độ càng cao thì quá trình deaetyl diễn ra càng nhanh nên sản phẩm chitosan thu đƣợc có DD cao [4].
Khi xử lý chitin ở nhiệt độ 60, 70oC độ deacetyl của chitosan phân tích đƣợc là 51%, 62%. Khi tăng nhiệt độ xử lý lên 80, 90oC, DD của chitosan đạt đƣợc lần
lƣợt là 75%, 88%. Kết quả phân tích ở trên có sự chênh lệch không lớn so với nghiên cứu của Jooyeoun Jung và Yanyun Zhao (2011) khi sử dụng phƣơng pháp Kurita khi xử lý nang mực ở điều kiện 90oC, NaOH 40% trong ít nhất 4h (DD >90%), theo tác giả này, điều kiện tối ƣu để đạt đƣợc DD >95% khi xử lí bằng NaOH 40%, 50% ở 90 oC trong 6h. Sự chênh lệch này có thể do sự khác nhau của quá trình tiền xử lý chitin trƣớc khi deacetyl [12].
Nhƣ vậy để đảm bảo chất lƣợng của chitosan (DD>85%) thì nhiệt độ 900C đƣợc lựa chọn để deacetyl β-chitin và kết quả này đƣợc sử dụng trong các thí nghiệm về sau.
3.9. Kết quả xác ịnh ảnh hƣởng của thời gian ến DD của chitosan
Chitin đƣợc rửa sạch, phơi khô, xử lí bằng NaOH 50%, tỉ lệ β-chitin/NaOH là 1:5, ở 90oC trong các khoảng thời gian 4, 8, 12, 16, 20h. Kết quả xác định ảnh hƣởng của thời gian đến DD của chitosan đƣợc trình bày ở Hình 3.8.
a b c d e 0 20 40 60 80 100 4 8 12 16 20 D D ( % ) Thời gian(h) Hình 3.8. Ảnh hƣởng của thời gian ến DD của chitosan
Kết quả phân tích cho thấy khi ta kéo dài thời gian xử lí thì DD của chitosan tăng dần. Qúa trình deacetyl chủ yếu diễn ra mạnh ở thời gian đầu, sau 4h, 8h, 12h DD của chitosan lần lƣợt đạt 59%, 73%, 85, Khi tăng thời gian xử lý lên 16h, 20h