2.2.1. Bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.2. Sơ ồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Nguyên liệu nang mực sau khi xác định các thành phần hóa học cơ bản (độ ẩm, hàm lƣợng khoáng, hàm lƣợng protein) đƣợc tiến hành nghiên cứu chế độ khử protein (nhiệt độ, thời gian, nồng độ NaOH) để thu đƣợc β-chitin có hàm lƣợng protein < 1%. Tiếp đó là xác định chế độ khử khoáng (thời gian, nồng độ HCl) để thu đƣợc β-chitin có hàm lƣợng khoáng < 1%.
β -Chitin sau khi thu hồi đƣợc nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố nhƣ nhiệt độ, nồng độ NaOH, thời gian deacetyl đến độ deacetyl chitosan với mục tiêu là sản xuất đƣợc chitosan có DD>85% với chi phí hóa chất, thời gian và chi phí năng lƣợng thấp nhất.
Nang mực
Nghiên cứu chế độ khử khoáng Nghiên cứu chế độ khử protein
Chitosan β-Chitin
Nghiên cứu chế độ deacetyl
Đánh giá chất lƣợng chitosan
Đề xuất quy trình sản xuất chitosan
Phân tích thành phần hóa học
Phân tích thành phần hóa học
2.2.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết
2.2.2.1. Nghiên cứu iều kiện khử protein và khử khoáng nang mực trong quá trình sản xuất β-chitin.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hàm lượng protein còn lại
của β-chitin.
Mục tiêu thí nghiệm: Chọn đƣợc nồng độ NaOH thích hợp sao cho hàm lƣợng protein còn lại trong β-Chitin <1%.
Hình 2.3. Sơ ồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng NaOH trong quá trình khử protein.
Ngâm nang mực trong dung dịch NaOH với tỉ lệ NaOH/nang mực là 5:1 (v/w) ở các nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%, ủ ở 800 trong 12h, tiến hành khuấy trong quá trình ủ để nang mực tiếp xúc đều trong NaOH. Sau 12h, lấy mẫu ra, rửa bằng nƣớc sạch nhiều lần cho hết kiềm, vắt khô để tiếp tục quá trình khử khoáng.
β-Chitin. Phân tích hàm lƣợng protein Nang mực đã qua xử lí
Ngâm trong NaOH ở các nồng độ khác nhau với tỉ lệ 1:5(w/v) ở 800C trong 12h
Rửa trung tính, vắt khô
5% (w/w) 4% (w/w) 3% (w/w) 2% (w/w) 1% (w/w) Khử khoáng ( HCl 0,5% (v/v) /2h /RT)
Khử khoáng bằng HCl 0,5% (v/v), tỉ lệ HCl/nang mực là 5:1 (v/w) trong 2h ở nhiệt độ phòng, sau đó rửa sạch thu đƣợc β-Chitin, phân tích hàm lƣợng protein từ đó chọn nồng độ NaOH thích hợp trong quá trình khử protein.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình khử protein
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nhiệt độ khử protein thấp nhất để hàm lƣợng protein <1%.
Hình 2.4. Sơ ồ bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của nhiệt trong quá trình khử protein
Ngâm nang mực trong dung dịch NaOH với nồng độ thích hợp đã xác định ở thí nghiệm đƣợc bố trí ở Hình 2.3, tỉ lệ NaOH/nang mực là 5:1(v/w), ủ ở 700C, 800C, 900C trong 12h, tiến hành khuấy trong quá trình ủ để nang mực tiếp xúc đều trong NaOH. Sau 12h, lấy mẫu ra, rửa bằng nƣớc sạch nhiều lần cho hết kiềm, vắt khô để tiếp tục quá trình khử khoáng.
Nang mực đã qua xử lí
Ngâm trong NaOH tỉ lệ 5:1(v/w) trong 12h
Khử khoáng ( HCl 0,5% /2h / RT) Rửa trung tính, vắt khô
900C 800C 700C β-Chitin. Phân tích hàm lƣợng protein
Khử khoáng bằng HCl 0,5% (v/v), tỉ lệ HCl/nang mực là 5:1 (v/w) trong 2h ở nhiệt độ phòng, sau đó rửa sạch thu đƣợc β-Chitin, phân tích hàm lƣợng protein từ đó chọn nhiệt độ thích hợp trong quá trình khử protein.
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trong quá trình khử protein
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra thời gian khử protein ngắn nhất để hàm lƣợng protein <1%.
Hình 2.5. Sơ ồ bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của thời gian trong quá trình khử protein
Ngâm nang mực trong dung dịch NaOH với nồng độ và nhiệt độ thích hợp đã xác định ở thí nghiệm đƣợc bố trí ở Hình 2.3 và Hình 2.4, trong các khoảng thời gian 4, 8, 12, 16, 20 giờ, tiến hành khuấy trong quá trình ủ để nang mực tiếp xúc đều trong NaOH sau đó rửa bằng nƣớc sạch nhiều lần cho hết kiềm, vắt khô để tiếp tục quá trình khử khoáng.
Nang mực đã qua xử lí
Ngâm trong NaOH và với nồng độ và nhiệt độ thích hợp, tỉ lệ 5:1(v/w)
Khử khoáng ( HCl 0,5% /2h / RT) Rửa trung tính, vắt khô
16h 12h 8h β-Chitin 4h 20h Phân tích hàm lƣợng protein
Khử khoáng bằng HCl 0,5% (v/v), tỉ lệ HCl/nang mực là 5:1(v/w) trong 2h ở nhiệt độ phòng, sau đó rửa sạch thu đƣợc β-Chitin, phân tích hàm lƣợng protein từ đó chọn thời gian thích hợp trong quá trình khử protein.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ HCl và thời gian trong quá trình khử
khoáng.
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra đƣợc nồng độ HCl và thời gian khử khoáng thích hợp để hàm lƣợng khoáng <1%.
Hình 2.6. Sơ ồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng HCl trong quá trình khử khoáng
Sau khi chọn đƣợc chế độ khử protein thích hợp, tiến hành ngâm nang mực trong dung dịch HCl 0%, 0,1%, 0,25%, 0,5%, 1% tỉ lệ HCl/nang mực là 5:1(v/w), để ở nhiệt độ phòng trong 2, 4, 6, 8 h.
Sau các khoảng thời gian trên, mẫu đƣợc rửa bằng nƣớc sạch phơi khô, phân tích hàm lƣợng khoáng để chọn nồng độ HCl và thời gian xử lý thích hợp.
Nang mực đã khử protein
Ngâm trong HCl, tỉ lệ 5:1(v/w), nhiệt độ phòng
Rửa sạch, phơi khô Ngâm trong 0, 2, 4, 6, 8h 0,5% 0,25% 0,1% Phân tích hàm lƣợng khoáng 1% 0%
2.2.2.2. Nghiên cứu chế độ deacetyl β-chitin để sản xuất chitosan
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH trong quá trình deacetyl để sản
xuất chitosan.
Mục đích thí nghiệm: xác định nồng độ NaOH thích hợp trong quá trình deacetyl để sản xuất chitosan để chitosan có độ deacetyl >85%.
Hình 2.7. Sơ ồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng NaOH trong quá trình deacetyl ể sản xuất chitosan
Ngâm β-chitin trong NaOH ở các nồng độ 30, 40%, 50%, 60% (w/w), tỉ lệ NaOH/β-chitin là 5:1 (v/w), ủ 900
C trong 12h.
Sau 12h, lấy ra, rửa bằng nƣớc sạch nhiều lần để loại hết kiềm, phơi khô sẽ thu đƣợc chitosan. Phân tích độ deacetyl chitosan để lựa chọn nồng độ NaOH thích hợp.
Đánh giá chất lƣợng β -Chitin
Ngâm trong NaOH, tỉ lệ 5:1(v/w)
Rửa trung tính, phơi khô Ủ ở 900C trong 12h 60% (w/w) 50% (w/w) 40% (w/w) Chitosan 30% (w/w)
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình deacetyl để sản xuất chitosan.
Mục đích thí nghiệm: xác định nhiệt độ thích hợp trong quá trình deacetyl để chitosan có độ deacetyl >85%.
Hình 2.8. Sơ ồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt trong quá trình deacetyl ể sản xuất chitosan.
β -Chitin ngâm trong NaOH với nồng độ đã xác định ở thí nghiệm bố trí trên Hình 2.7, tỉ lệ NaOH/nang mực là 5:1 (v/w) trong 12h ở 600
C, 700C, 800C, 900C. Sau 12h, lấy ra rửa bằng nƣớc sạch nhiều lần để loại hết kiềm, phơi khô sẽ thu đƣợc chitosan, đánh giá chất lƣợng của chitosan: DD, Mw, protein để chọn nhiệt độ thích hợp để sản xuất chitosan có chất lƣợng tốt.
Đánh giá chất lƣợng β -chitin
Ngâm trong NaOH, tỉ lệ 5:1(v/w), trong 12h
Rửa trung tính, phơi khô 900C 800C 700C Chitosan 600C
Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trong quá trình deacetyl để sản xuất chitosan
Mục đích thí nghiệm: xác định thời gian thích hợp trong quá trình deacetyl để để chitosan có độ deacetyl >85%.
Hình 2.9. Sơ ồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian trong quá trình deacetyl ể sản xuất chitosan.
β -chitin ngâm trong NaOH với nồng độ và nhiệt độ đã xác định ở thí nghiệm bố trí trên Hình 2.7 và Hình 2.8, tỉ lệ NaOH/nang mực là 5:1(v/w) trong các khoảng thời gian 4, 8, 12, 16, 20 giờ sau đó, lấy ra rửa bằng nƣớc sạch nhiều lần để loại hết kiềm, phơi khô sẽ thu đƣợc chitosan, đánh giá chất lƣợng của chitosan: DD, Mw, protein để chọn thời gian thích hợp để sản xuất chitosan có chất lƣợng tốt.
Đánh giá chất lƣợng β -chitin
Ngâm trong NaOH 50%, tỉ lệ 5:1(v/w), ở 900C
Rửa trung tính, phơi khô 16h 12h 8h Chitosan 4h 20h
2.2.3. Các phƣơng pháp phân tích
Xác định độ deacetyl bằng phƣơng pháp quang phổ (UV) (Tao và cộng sự 2008).
Xác định lƣợng protein chitin, chitosan bằng phƣơng pháp Microbiuret (Ruth F. Itzhaki và cộng sự 1964).
Phƣơng pháp xác định trọng lƣợng phân tử trung bình của chitosan theo phƣơng pháp đo độ nhớt nội (Hua và cộng sự 2001).
Xác định hàm lƣợng tro tổng số theo tiêu chuẩn TCVN 5105-1990.
Định lƣợng lipid bằng phƣơng pháp Soclext theo tiêu chuẩn TCVN 3703- 1990.
Xác định hàm ẩm theo tiêu chuẩn TCVN 3700-1990.
Xác định độ nhớt biểu kiến của chitosan bằng nhớt kế Brookefile.
2.2.4. Phƣơng pháp xử lí số liệu
Số liệu báo cáo là trung bình của 3 lần phân tích. Kết quả đƣợc phân tích thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel và SPSS 16.0. Giá trị của p < 0,05 đƣợc xem là có ý nghĩa về mặt thống kê.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác ịnh thành phần hóa học cơ bản của nang mực
Nang mực sau khi thu mua tại một số cơ sở chế biến thuộc tỉnh Kiên Giang đƣợc vận chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản ở -20oC đến khi tiến hành thí nghiệm. Kết quả phân tích thành phần hóa học ban đầu của nang mực đƣợc thể hiện trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản cơ bản của nang mực
Chỉ tiêu phân tích Kết quả phân tích
Độ ẩm (%) 12,2 ± 0,12
Hàm lƣợng khoáng* (%) 2,4 ± 0,05 Hàm lƣợng protein* (%) 7,3 ± 0,18
Hàm lƣợng lipid* (%) 3,1 ± 0,15
Hàm lƣợng chitin* (%) 85,8 ± 0,25 *: Tính theo trọng lƣợng khô tuyệt đối
Kết quả phân tích cho thấy nang mực chứa thành phần chính là β-chitin (85,8%), ngoài ra còn có chứa một lƣợng protein (7,3%), khoáng (2,4%) và lipid (3,1%). Số liệu phân tích tƣơng ứng với kết quả nghiên cứu của No và Meyers, 1997 với hàm lƣợng β-chitin, protein và khoáng trong nang mực đạt lần lƣợt là 80%; 8,3% và 1,2% [19]. Tuy nhiên, kết quả công bố của Cortizo, S. và đồng tác giả (2008) [21], Kurita và đồng tác giả (1993) có sự chênh lệch, theo các tác giả trên thì hàm lƣợng khoáng chỉ chiếm khoảng 1%, 30 – 40% β-chitin [14]. Theo Rhazi, M. (2000), hàm lƣợng β-chitin trong nang mực chiếm khoảng 40% [20], kết quả này chênh lệch khá lớn so với hàm lƣợng β-chitin phân tích từ nang mực thu nhận tại Kiên Giang.
Kết phân tích cho thấy, hàm lƣợng β-chitin trong nang mực cao (85,8%) do đó cần tiến hành các nghiên cứu thu nhận. Tuy nhiên nang mực chiếm một lƣợng protein và khoáng đáng kể do vậy cần phải nghiên cứu chế độ khử protein, khử khoáng thích hợp để thu nhận β-chitin.
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng NaOH ến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin trong quá trình khử protein
Nang mực đƣợc cắt nhỏ với chiều dài 3 cm, sau đó đƣợc xử lý NaOH ở nhiệt độ phòng trong thời gian 12 giờ, tỷ lệ NaOH/nang mực là 5/1(v/w) ở các nồng độ 1, 2, 3, 4, 5% (v/v). Sau quá trình khử protein nang mực tiếp tục đƣợc khử khoáng với HCl 0,5% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Kết quả phân tích hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin đƣợc thể hiện trong Hình 3.1.
d c b a a 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 H àm lƣợn g pr ot ei n còn l ại c ủa β- chi ti n (% ) Nồng NaOH (%)
Theo kết quả phân tích ở Hình 3.1, hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin tỷ lệ nghịch với nồng độ NaOH, điều này hoàn toàn phù hợp với nhận định của Trung và cộng sự 2010 khi tăng nồng độ NaOH thì khả năng thủy phân tăng cao do đó hàm lƣợng protein còn lại thấp [4].
Khi xử lý NaOH với nồng độ 1, 2, 3 % hàm lƣợng protein còn lại tƣơng đối cao (>1%) Hàm lƣợng protein trong β-chitin khi xử lý NaOH 1, 2, 3 % lần lƣợt là 5,2%; 3,7%; 1,5%. Tuy nhiên khi tăng nồng độ NaOH lên 4, 5% hàm lƣợng protein trong β-chitin giảm mạnh và giá trị protein thu đƣợc khi xử lý NaOH 4, 5% lần lƣợt là 0,9%; 0,6%.
Nhƣ vậy, hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin khi xử lý NaOH 5% là thấp nhất (0,6%) tuy nhiên khi phân tích dữ liệu thống kê với phép toán tukey thì cho thấy không có sự khác biệt về hàm lƣợng protein ở công thức xử lý NaOH 4% và NaOH 5% do đó công thức xử lý NaOH 4% đƣợc cho là phù hợp và đƣợc sử dụng làm dẫn liệu cho các thí nghiệm về sau.
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt khử protein nang mực ến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin
Nang mực đƣợc xử lý với NaOH 4% trong thời gian 12 giờ, tỷ lệ NaOH/nang mực là 5/1 (v/w) với nhiệt độ 70oC, 80oC, 90oC để xem xét ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin. Kết quả phân tích hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin đƣợc thể hiện ở Hình 3.2.
c b a 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 70 80 90 H àm lƣợ ng p ro te in c òn lạ i tr on g β- c h iti n (% ) Nhiệt (oC)
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt ến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin
Nhiệt độ có ảnh hƣởng lớn đến quá trình thủy phân protein, theo Trung và cộng sự 2010, ở nhiệt độ thƣờng, quá trình tách protein diễn ra chậm, thời gian thủy phân từ 1 đến vài ngày. Khi nâng nhiệt độ xử lí, quá trình tách protein diễn ra nhanh do vậy có thể rút ngắn thời gian xử lý [4].
Kết quả Hình 3.2 cho thấy, nhiệt độ càng tăng thì hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin càng thấp điều này có thể do nhiệt độ cao đã xúc tác mạnh phản ứng thủy phân protein của NaOH, hơn nữa khi nhiệt độ cao thì quá trình đứt gãy các liên kết peptid xảy ra cũng dễ dàng hơn do đó quá trình tách protein ra khỏi nang mực diễn ra nhanh và mạnh hơn.
Kết quả Hình 3.2 cho thấy, hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin cao nhất khi xử lý ở 70oC (Hàm lƣợng protein còn lại là 1,05%) và thấp nhất khi xử lý ở 90oC (hàm lƣợng protein còn lại là 0,43%). Ở nhiệt độ xử lý 80oC, hàm lƣợng protein còn lại trong chitin là 0,57%.
Hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin khi xử lý ở 70, 80, 90o
C có sự khác nhau về mặt thống kê khi phân tích tukey tuy nhiên với yêu cầu của chitin thƣơng mại (hàm lƣợng protein <1%) thì việc xử lý ở 80oC là phù hợp, hàm lƣợng protien
khi xử lý ở nhiệt độ này là 0,57% và kết quả này đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm về sau.
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian xử lý NaOH ến hàm lƣợng protein còn lại của β-chitin.
Nang mực đƣợc xử lý với NaOH 4%, nhiệt độ 80oC, tỷ lệ NaOH/nang mực là 5/1 (v/w) trong thời gian 4, 8, 12, 16, 20 giờ để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian xử lý NaOH đến hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin. Kết quả phân tích hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin đƣợc thể hiện ở Hình 3.3.
e d c b a 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 4 8 12 16 20 H àm lƣợn g prot ei n còn l ại của β - chi ti n (% ) Thời gian (h)
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian ến hàm lƣợng protein còn lại của chitin
Từ kết quả phân tích trên ta thấy khi kéo dài thời gian xử lí hàm lƣợng protein giảm dần vì thời gian càng dài quá trình tách protein diễn ra càng mạnh [4].
Sau 4h và 8h xử lí, hàm lƣợng protein còn lại trong β-chitin còn cao >1%, sau 12h, 16h, 20h xử lí hàm lƣợng protein còn lại <1%, nhƣ vậy sau 12h, 16h, 20h xử lí đều thu đƣợc chitin đảm bảo hàm lƣợng protein còn lại <1%, để thuận lợi và tiết kiệm thời gian xử lí ta chọn 12h để khử protein vì thời gian dài sẽ làm cắt mạch sản phẩm chitin [4].
3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng HCl và thời gian khử khoáng ến hàm lƣợng khoáng còn lại của β-chitin
Mẫu sau khi xử lý NaOH 4%, trong thời gian 12 giờ với nhiệt độ 80C, đƣợc rửa trung tính và tiến hành khử khoáng với HCl 0; 0,1; 0,25; 0;5; 1% trong thời gian