2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu sử dụng trong đề tài này là cây Cẩm Tím (Peristrophe roxburghiana). Trồng tại huyện Ninh Hòa (tỉnh Khánh Hòa). Nguyên liệu được mua thành nhiều đợt, mỗi đợt khoảng 0,500 kg.
Theo tài liệu, hàm lượng chất màu tím trong lá Cẩm vào khoảng 12,72% trọng lượng lá, gấp 14,45 lần so với hàm lượng chất màu có trong từ thân cây Cẩm (0,88%) [3]. Do vậy, trong đề tài này chúng tôi chỉ sử dụng phần lá của cây Cẩm làm nguyên liệu chiết anthocyanin.
2.1.2. Hóa chất - Thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Etanol 96o Nước cất 1 lần
2.1.2.2.Thiết bị
Cân kỹ thuật 1 g (Việt Nam)
Cân phân tích 1 mg (Shimadzu, Nhật) Cân phân tích 0,1 mg (Satorius, Nhật) Bếp điện
Tủ sấy 10C (Memmer , Đức)
Bể siêu âm Elmasonic S300H (Elma, Đức) Thiết bị cô quay RV 10 Control (IKA, Đức) Quang kế UV-Vis Genesys 20 (Thermo, USA) Quang phổ kế CARY 50 (Varian, Australia)
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp xử lý và bảo quản nguyên liệu
Cây Cẩm tươi sau khi thu mua được đem ngay về phòng thí nghiệm, rửa sạch, để ráo, trộn đều. Nguyên liệu có thể dùng để nghiên cứu ngay hay cho vào các hộp
nhựa cứng (để khỏi bị dập nát) và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh để dùng dần (Thời gian bảo quản khoảng 1-2 ngày để tránh ảnh hưởng đến chất lượng chất màu).
2.2.2. Xác định thành phần khối lượng của nguyên liệu nghiên cứu
Nguyên liệu cây Cẩm sau khi rửa sạch và để ráo được chia thành 3 phần: phần lá tươi, phần lá úa và phần cành. Sau đó, cân các phần này và xác định thành phần khối lượng của nguyên liệu như sau:
% Lá tươi = .100% 0 1 m mL ; % Lá úa = .100% 0 2 m mL ; % Cành = .100% 0 m mC Trong đó:
mL1: khối lượng phần lá tươi mL2: khối lượng phần lá úa vàng mC: khối lượng phần cành
m0 : khối lượng nguyên liệu ban đầu ( m0 = mL1 + mL2 + mC)
Hình 2.1. Thí nghiệm xác định thành phần khối lượng của nguyên liệu
Rửa sạch, để ráo Cây Cẩm nguyên liệu
Lá tươi Lá úa Cành
Thành phần khối lượng Cân
2.2.3. Quy trình dự kiến chiết xuất chất màu anthocyanin từ lá Cẩm
Quy trình dự kiến sản xuất chất màu anthocyanin từ lá Cẩm và các yếu tố cần khảo sát được trình bày trong sơ đồ 2.2.
Hình 2.2. Quy trình dự kiến sản xuất chất màu anthocyanin từ lá Cẩm và các yếu tố cần khảo sát Xử lý Lá Cẩm tươi Lọc Chiết Dịch chiết
Khảo sát điều kiện chiết: - Dung môi: H2O;
Etanol 960-H2O (tỷ lệ Etanol )
- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
- Phương pháp chiết : ngâm; siêu âm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nhiệt độ chiết
- Thời gian chiết
- Số lần chiết
Bổ sung maltodextrin Cô đuổi dung môi
Sấy phun
Dịch chiết anthocyanin thô cô đặc
Giải thích quy trình
Xử lý: Cây Cẩm sau khi thu mua được đem rửa sạch, để ráo, loại bỏ cành
và các lá vàng, sau đó được cắt nhỏ kích thước 1-3 mm.
Chiết: Tiến hành chiết chất màu anthocyanin bằng dung môi (etanol 960- H2O sử dụng phương pháp chiết thích hợp
Lọc: loại bỏ bã chiết và các tạp chất không tan để thu lấy dịch chiết.
Cô đuổi dung môi: Dịch chiết thu được đem cô đuổi dung môi dưới áp suất
thấp, trong bóng tối, nhiệt độ không quá 60oC nhằm hạn chế sự phân hủy chất màu anthocyanin bởi nhiệt và ánh sáng.
Bổ sung maltodextrin: Sau khi dịch chiết anthocyanin được cô đặc đến nồng độ chất khô xác định, tiến hành bổ sung maltodextrin với tỷ lệ thích hợp cho việc sấy phun.
Sấy phun: hỗn hợp anthocyanin-maltodextrin để thu bột màu anthocyanin Đóng gói – Bảo quản: Sản phẩm bột màu anthocyanin từ lá Cẩm được đem
đóng gói trong bao bì kín, bảo quản trong tối ở nhiệt độ thấp.
2.2.4. Xác định điều kiện thích hợp cho việc chiết anthocyanin từ lá Cẩm
Để xây dựng được quy trình chiết bột màu anthocyanin đạt hiệu suất cao, cần nghiên cứu sự phụ thuộc của hiệu suất chiết anthocyanin vào các yếu tố: tỷ lệ etanol 960–H2O; tỷ lệ dung môi/nguyên liệu; phương pháp chiết; nhiệt độ chiết; thời gian chiết và số lần chiết, trong đó các thông số trên thay đổi như sau:
- Tỷ lệ etanol 960-H2O: thay đổi từ 0 100% (v/v); bước nhảy: 20% (v/v) - Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 2/110/1 (v/w); bước nhảy 2/1 (v/w)
- Phương pháp chiết: phương pháp ngâm; phương pháp siêu âm - Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng (280C); 40; 60; 80; 1000C
- Thời gian chiết: 10 60 (phút); bước nhảy 10 phút
- Số lần chiết: 1 4 (lần).
Việc xác định thông số thích hợp được thực hiện bằng phương pháp thực nghiệm yếu tố từng phần cổ điển (thay đổi 1 yếu tố trong khi cố định các yếu tố còn lại).
2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ etanol 960-H2O thích hợp:
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ etanol 960-H2O thích hợp
b) Thuyết minh sơ đồ:
Cân chính xác khoảng 1 g nguyên liệu (đã cắt nhỏ, trộn đều) cho vào các bình nón 100 ml. Thêm dung môi chiết vào, trong đó cố định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 50/1(v/w), còn tỷ lệ etanol 960- H2O thay đổi lần lượt là 0%; 20%; 40%; 60%;
Thêm EtOH 960-H2O (tỷ lệ dung môi/nguyên liệu = 50/1 (v/w) Lá Cẩm tươi
Siêu âm (20 phút, t0phòng) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lọc
Dịch chiết
Đo độ hấp thụ
So sánh hiệu suất chiết Tỷ lệ etanol 96 0
-H2O thíchhợp
Thay đổi tỷ lệ etanol 960-H2O (v/v)
80% và 100% (v/v). Bịt kín các bình nón rồi tiến hành chiết bằng cách siêu âm trong 20 phút ở nhiệt độ phòng (280C). Sau đó, lọc lấy dịch chiết rồi đem định mức bằng nước cất đến một thể tích chính xác (D ml) rồi đo độ hấp thụ của các dung dịch ở 585 nm. Đánh giá hiệu suất chiết anthocyanin từ đó chọn dung môi chiết thích hợp.
2.2.4.2. Bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu:
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
Lá Cẩm tươi
Thêm dung môi chiết thích hợp
Siêu âm (20 phút, t0phòng)
Lọc
Dịch chiết
Đo độ hấp thụ
So sánh hiệu suất chiết
Tỷ lệ
dung môi/nguyên liệu
thích hợp
Thay đổi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
b) Thuyết minh sơ đồ:
Cân chính xác khoảng 1 g nguyên liệu (đã cắt nhỏ, trộn đều) cho vào các bình nón 100 ml. Thêm dung môi chiết thích hợp, trong đó tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thay đổi lần lượt là: 2/1; 4/1; 6/1; 8/1; 10/1 (v/w). Bịt kín các bình nón rồi siêu âm trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy dịch chiết, định mức bằng nước cất đến một thể tích chính xác (D ml). Đo độ hấp thụ của các dung dịch ở 585 nm. Đánh giá hiệu suất chiết anthocyanin. Từ đó, chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp.
2.2.4.3. Bố trí thí nghiệm chọn dung môi, nhiệt độ chiết
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm chọn dung môi, nhiệt độ chiết thích hợp NGÂM CHIẾT (20 phút):
- Thay đổi tỷ lệ Etanol/H2O:
0; 20; 40; 60; 80; 100 (% v/v)
- Thay đổi nhiệt độ:
t0phòng; 40; 60; 80; 100 (0C) Lá Cẩm tươi Thêm hỗn hợp Etanol 960-H2O (Tỷ lệ DM/NL thích hợp) Lọc Dịch chiết Đo độ hấp thụ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
So sánh hiệu suất chiết
Dung môi, nhiệt độ, phương pháp chiết
thích hợp
SIÊU ÂM (20 phút):
- Thay đổi tỷ lệ Etanol/H2O:
0; 20; 40; 60; 80; 100 (% v/v)
- Thay đổi nhiệt độ:
b) Thuyết minh sơ đồ:
Nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết. Trên thực tế,hiệu suất chiết phụ thuộc đồng thời vào bản chất dung môi, nhiệt độ. Do đó, một dung môi có hiệu quả chiết tốt nhất ở nhiệt độ phòng có thể không phải là dung môi chiết tốt nhất ở nhiệt độ cao hơn. Vì vậy, để chọn nhiệt độ chiết thích hợp cần thay đổi đồng thời dung môi và nhiệt độ.
Trong đề tài này, tôi sẽ nghiên cứu chiết anthocyanin trong 2 trường hợp sau: - Ngâm chiết có gia nhiệt, sử dụng dung môi là H2O và etanol 960-H2O,trong đó nhiệt độ thay đổi từ t0phòng 1000C
- Siêu âm có gia nhiệt, sử dụng dung môi H2O và etanol 960-H2O, trong đó nhiệt độ thay đổi từ t0phòng 800C (do thiết bị siêu âm tôi sử dụng chỉ có thể đạt nhiệt độ tối đa là 800C).
Tiến hành:
Cân chính xác khoảng 1 g nguyên liệu (đã cắt nhỏ, trộn đều) cho vào các bình nón 100 ml, chia làm 2 lô thí nghiệm:
- Lô TN1: Thêm H2O và etanol 960-H2O (tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp đã được xác định từ kết quả thí nghiệm 2.2.4.1). Đậy kín, cho vào tủ sấy (đã gia nhiệt đến nhiệt độ xác định) trong 20 phút. Nhiệt độ thay đổi lần lượt là:
t0phòng; 400C; 600C; 800C và 1000C.
Sau đó, lấy ra lọc lấy dịch chiết, định mức bằng nước cất đến một thể tích chính xác (D ml). Đo độ hấp thụ của các dung dịch ở 585 nm. Đánh giá hiệu suất chiết anthocyanin.
- Lô TN2: Tiến hành tương tự lô TN1 nhưng nhưng cho vào bể siêu âm trong 20 phút, trong đó nhiệt độ siêu âm thay đổi lần lượt là:
ttphòng; 400C 600C và 800C.
So sánh hiệu suất chiết ở từng phương pháp từ đó chọn dung môi và nhiệt độ phù hợp.
2.2.4.4. Bố trí thí nghiệm chọn thời gian chiết
a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết
b) Thuyết minh sơ đồ:
Cân chính xác khoảng 1 g nguyên liệu (đã cắt nhỏ, trộn đều) cho vào các bình nón 100 ml. Thêm dung môi với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp. Đậy kín rồi tiến hành chiết bằng phương pháp chiết và ở nhiệt độ thích hợp, trong đó thời gian chiết thay đổi như sau: 10; 20; 30; 40; 50; 60 (phút). Lọc lấy các dịch chiết, định
Lá Cẩm tươi
Chiết
(Dung môi, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ, phương pháp chiết thích hợp)
Thời gian chiết (cho 1 lần chiết)
Lọc
Dịch chiết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đo độ hấp thụ
So sánh hiệu suất chiết Thời gian chiết
thích hợp
mức bằng nước cất đến một thể tích chính xác (D ml). Đo độ hấp thụ của các dung dịch ở 585 nm. Đánh giá hiệu suất chiết anthocyanin. Từ đó, chọn thời gian chiết phù hợp. 2.2.4.5. Bố trí thí nghiệm chọn số lần chiết: a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định số lần chiết Lá Cẩm tươi Chiết
(Dung môi, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ,
phương pháp chiết, thời gian chiết thíchhợp)
Số lần chiết 1 lần 2 lần 3 lần 4 lần Lọc Dịch chiết tổng cộng sau Đo độ hấp thụ
Xác định hiệu suất chiết Số lần chiết
b) Thuyết minh sơ đồ:
Cân chính xác khoảng 1 g nguyên liệu (đã cắt nhỏ, trộn đều) cho vào các bình nón 100 ml. Tiến hành chiết (sử dụng dung môi, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ, phương pháp và thời gian chiết đã chọn).
Sau mỗi lần chiết, lọc lấy dịch. Lặp lại quá trình chiết như trên với bã còn lại cho đến khi đạt được số lần chiết n xác định (n = 1, 2, 3, 4). Gộp lấy dịch chiết thu được sau n lần chiết của từng mẫu một, định mức bằng nước cất đến một thể tích chính xác (D ml). Đo độ hấp thụ của các dung dịch ở 585 nm. Đánh giá hiệu suất chiết anthocyanin. Từ đó, chọn số lần chiết phù hợp cho mỗi dung môi và phương pháp chiết.
2.2.5. Đề xuất quy trình chiết anthocyanin từ lá Cẩm – Thử nghiệm quy trình – Đánh giá hiệu suất chiết của toàn bộ quy trình trình – Đánh giá hiệu suất chiết của toàn bộ quy trình
Sau khi đã chọn được các thông số thích hợp như trên, có thể đề xuất các quy trình chiết anthocyanin lá Cẩm phù hợp với các dung môi và phương pháp chiết khác nhau. Tiến hành chiết thử nghiệm trên các mẫu lớn (0,5 kg/mẫu). Thu các dịch chiết tổng cộng. Đo quang để xác định hàm lượng anthocyanin chiết được và tính hiệu suất chiết của toàn bộ quy trình.
Các dịch chiết anthocyanin sau đó được cô đặc đến nồng độ nhất định để tiến hành sấy phun. Do thời gian hạn chế nên đề tài này không tiến hành sấy phun dịch chiết anthocyanin cô đặc để thu sản phẩm dạng bột.
2.2.6. Nghiên cứu một số đặc tính của chất màu anthocyanin chiết xuất từ lá Cẩm lá Cẩm
2.2.6.1. Khảo sát sự thay đổi màu sắc theo pH
Mỗi loại thực phẩm có pH nằm trong một khoảng xác định. Trong khi đó, một trong các đặc tính của anthocyanin là khả năng thay đổi màu sắc theo pH. Vì vậy, để có thể sử dụng chất màu anthocyanin chiết xuất từ lá Cẩm cho mục đích tạo màu một loại thực phẩm nào đó, cần nghiên cứu sự thay đổi màu sắc của chất màu này trong các khoảng pH khác nhau.
Lấy 1 ml dịch chiết anthocyanin cho vào 10 ống nghiệm có nút vặn. Pha loãng các dịch chiết trên 10 lần bằng các dung dịch đệm có pH lần lượt là 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10. Vặn chặt nút, lắc đều các dung dịch, để yên trong 5 phút. Quan sát màu sắc và ghi phổ hấp thụ UV-Vis của tất cả các dung dịch. Nhận xét, so sánh và kết luận.
b) Sơ đồ thí nghiệm:
Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến màu sắc của chất màu anthocyanin chiết xuất từ lá Cẩm
2.2.6.2. Khảo sát độ bền màu của dịch chiết anthocyanin từ lá Cẩm trong các điều kiện bảo quản khác nhau các điều kiện bảo quản khác nhau
Độ bền của một chất màu trong quá trình bảo quản là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của thực phẩm. Nếu cường độ màu của chất màu giảm nhanh hay bị biến đổi sang màu khác thì sẽ tạo cho người tiêu dùng cảm giác sản phẩm đó đã bị hư hỏng mặc dù sản phẩm đó vẫn còn trong thời hạn sử dụng. Vì vậy, việc nghiên cứu độ bền của chất màu trong các điều kiện bảo quản
10 ống nghiệm
(Mỗi ống chứa 1 ml dịch chiết anthocyanin)
- Quan sát màu
- Ghi phổ hấp thụ UV-Vis của các dung dịch
Nhận xét – Kết luận
Pha loãng 10 lần bằng các dung dịch đệm
Thay đổi pH dung dịch đệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
khác nhau là điều có ý nghĩa quan trọng trước khi quyết định đưa một chất màu nào đó ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Do đó, chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự biến đổi nồng độ anthocyanin trong các dịch chiết chất màu từ lá Cẩm theo thời gian trong các điều kiện bảo quản sau:
Đậy kín, ở -20oC
Đậy kín, ở 40C
Đậy kín, ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối
Đậy kín, ở nhiệt độ phòng, dưới ánh sáng tự nhiên Xác định % anthocyanin còn lại theo công thức:
% Anthocyanin còn lại = (Lượng anthocyanin còn lại/Lượng anthocyanin ban đầu).100%
Từ kết quả nghiên cứu, rút ra kết luận về khả năng sử dụng và điều kiện thích hợp để bảo quản chất màu anthocyanin.
Hình 2.9. Bố trí thí nghiệm khảo sát độ bền màu của chất màu lá Cẩm trong một số điều kiện bảo quản khác nhau
Điều kiện bảo quản
Dịch chiết anthocyanin Đậy kín, ánh sáng tự nhiên, tphòng Đậy kín, trong tối, -20oC Đậy kín, trong tối, 4oC Đậy kín, trong tối, tphòng
Quan sát - Đo quang – Đánh giá
Thời gian bảo quản
2.2.7. Các phương pháp phân tích sử dụng trong đề tài
a) Xác định hàm lượng nước trong nguyên liệu: sấy ở 105- 1100C đến khối lượng không đổi (Phụ lục 1)
b) Xác định bước sóng hấp thụ cực đại của anthocyanin trong lá Cẩm
c) Xác định hàm lượng anthocyanin tổng số trong nguyên liệu lá Cẩm: chiết anthocyanin bằng nước cất và đo độ hấp thụ của dung dịch ở 585 nm d) Xác định hàm lượng anthocyanin trong các dịch chiết: Phương pháp đo
quang
2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả đều là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm song song. Xử lý số liệu và vẽ đồ thị bằng phần mềm MS Excel 2003.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thành phần khối lượng cây Cẩm
Kết quả xác định thành phần khối lượng nguyên liêu của cây Cẩm được trình bày ở bảng 3.1.