I nul l 111 haul) hrniiL: 11 mil Hu m: l li.il rương D ai hoc KilOLi hoc tư nhicn Dai hoc Ounc ' i a la Nô
1. Đối tượng và phương pháp
Vi khuẩn Photorhabdus luminescens Hp được phân lập từ tuyến trùng
Helerorliơbditis bacteriophora HP88 do Phòng Tuyên trùng, Viện Sinh thái và Tài
nguyẻn Sinh vật cung cấp.
Vi khuẩn được phân lâp trẽn môi trường NBTA-môi trường dinh dưỡng agar (3g cao thịt 5g pepton, 15g thạch, dẫn nước đến 1 lít, tiệt trùng trong 30 phút ở 0,8 atm) có chứa 25mg Bromothymol Blue và 40mg Triphenyltetrazolium Chloride. Tách một khuan lạc, cấy vào môi trường dinh dưỡng không có agar. Nuối cấy được thực hiên trên máy lãc ôn
nhiêt 2^0 vònơ/phút ờ 30"c. lắc C]ua đêm . Sau đó, 2m l dich nuôi cây được ch u yen \a o
lOOml mỏi trường dinh dưỡng như trên và lắc ó' 30"c trong 48 giờ.
Dịch nuôi cấy sau 48 ạiờ được ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ờ 4"C, thu láy dịch trong, sau đó loc qua màng 0,22|iin và sử dung cho nghiên cứu.
Xác định boat độ pioteinaz theo phương pháp Kunitz có cải tiến như đã mó ta từ trước [6].
Điên di proteinaz theo phương pháp cùa Heussen \'à Dowdle (1980) [5]. Chuán bị
mẫu như sau: mẫu được ú với EDTA trong 10 phút với nồng độ cuối cung trong hỗn hop
phản ứn« bằna 10 'M, bổ sung ion với nồng độ cuối cùng băng 10 ‘M và 2.5.10 \1.
C h ữ viữt
pheny
lưr ,ẳn DM SO: dimethyl sulfoxide. ĐC: dõi chưng. HDT.V cihvicndiain.ne.ciraacct.c 1'MSI-
2. Két q uá và bàn luân 2 . 1 . p H i l l i c i t i ì ự p c ù a c n z y n t Đệm Sorensen 0.2M (pH 6.0' 7.0 và 8,0); dệm Briton 0.2M (p|Ị 9.0 và 10,0) dã dược dùng đế xác định pH thích hợp với cơ chất azoalbumin.
Kết quả ớ hình 1 dã cho tháy hoại dộ enzym dal cực dai tại pH 8.0. Hoạt độ của enzym giảm dần ớ pH 7,0 và 6,0, đặc biệt giảm manh tại pH 9,0 và 10,0. Như vậy pH thích hợp cho hoạt động của enzym là pH 8.0.
£
„11
Hình 1. Anh hướng cùa pH (lốn hoạt dỏ proteinaz dịch ngoại bào vi khuẩn
p.lum inesccns Hp
2.2. Độ bén nhiệt của enzym
Mẫu được ủ ớ 6Ơ’C trong các khoảng thời gian: 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50 và 60 phút. Sau mỗi thời gian ủ, mầu được lấy ra
T h ờ i g i a n x ừ lý n h i ệ t ( p h ú t )
Hình 2. Độ bền nhiệt của proteinaz trong dịch ngoại bào vi khuẩn p, luminescens Hp và cho ngay vào 4"C. Tiếp theo, xác
định hoạt độ enzym trong điều kiện đã nẽu. Kết quả thu được cho thấy: sau 5 phút ủ ờ 60°c hoạt độ enzym giảm di nhanh chóng, chỉ còn 51,8% và sau 10 phút hoạt độ enzym chỉ
c òn lại 2 3 ,9 % s o VỚI h oạt đ ộ ban
đầu (hình 2). Điều này chứng tỏ enzym trong dịch ngoại bào do vi khuẩn p. lum inescens Hp tiết ra kém bền với nhiệt.
2.3. Ảnli hưởng cùa các chất ức c h ế đặc hiệu nhóm đến hoại độ enzym
CÁC chất ức chế đặc hiệu được
nghiên cứu gồm: PMSF, pCMB, EDTA và o-phe, Enzym được ủ với các chất ức chế có nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng bằng 10 'M trong 10 phút. Sau đó xác định hoạt độ enzym theo phương pháp Kunitz.
Kết quả đã cho thấy enzvm bị ức chế mạnh nhât bời EDTA (ức chế tới 86.6% hoạt độ), sau đó đôn PMSF (ức chế 27,9%). Các chất còn lại không ảnh hưởng tới hoạt độ của enzym (hình 3). 140 120 •3 Ì(K) •õ cx 1 80 5 60 o - ■o 40 ra- o 20 X 0 M — P M S F p C M B E D T A o- phe D V tS O DC
Hình 3: Ảnh hướng của các chất ức ch ếđă c hiệu nhóm đến hoạt đô proteinaz dịch ngoai bao vi
khuẩn p. iưnúncscens Hp
in
2.4. Ảnh h ư ớ n g n i a c á c io n kim lo ạ i lu 1(1 trị lun d e n hoa! (In a i : \
Các ion kim loại dược nchién cứu gồm: M n’2, Ca+Ỉ, Fc*\ Cd42 Ba*2, Mg*:, Pb<:. Co* , Zn . Ni+\ Cu’2 và Hg+ với nồng dô cuoi cùng trong hỗn hợp phàn ứng là
10 M.
Kếl quá trên hình 4 dã cho thấy các ion M r f \ Ca"2, Fe*2 có tác
dụ n g tăng c ư ờ n g hoạt đ ộ e n z y m .
Các ion Hg+2, C u+2, Ni+2, Zn"2 Co42 và Pb+2 ức chế hoạt độ enzym trong đó ion H g+2 tác dụng mạnh nhất (ức chế 68%). Còn lại các ion Cd2+, Ba2+ và M g2+ ảnh hướng không rõ ràng đến hoạt độ enzym.
2.5. Thành phẩn proteinaz trong dịclì ngoại bào vi khuẩn p. luminescens Hp
Bằng phương pháp điện di enzym chúng tôi đã thu được kết quả về thành phán proteinaz trong dịch nghiên cứu (hình 5),
Dựa vào kết quả điện di có thể chia các proteinaz thành ba khu vực lớn. Khu vực I gồm các proteinaz có độ di động diện di (Rm) từ 0,0 đến 0,1, trong đó có hai bàng enzym chính: băng 1 (Rm= 0,034) và băng 2 (Rm= 0,086). Khu vực II chứa các proteinaz có độ di động điện di từ 0,293 đến 0,345 và enzym ờ khu vực III có độ di đông điện di 0,46.
Điện di enzym ủ với các chất ức chế đặc hiệu, chúng tôi nhận thấy PMSF ức chê toàn bộ các proteinaz nằm trong khu vực I và II còn EDTA ức chế các proteinaz khu vực I (ức chế hoàn toàn băng Rm= 0,034 và một phần băng Rm= 0,086). Enzym thuộc khu vực III hầu như khổng bị ức chế bởi EDTA và PMSF.
1 2 3 4
m IHKT
Khu xực I
Hình 4. Anh hưởng của các ion kim loại hoá trị hai lén hoạt độ proteinaz dịch ngoại bào vi khuấn
P. lum inescent Hp
Hình 5 Điện di trên gel polyacrylamit 7,5% có SDS và gelatin 0,19c các
p r o te inaz của p. lum inescent Hp
Giếne 1 • Đ C -D M S O . 2: ức c h ế bởi PMSF. 3: ức chê bời EDTA, 4: ĐC- I M )
'Iliư ánh hương cua các IOI1 kim 1 ( H I h„í Ir, K ■ I ■
cho thav: ! 1 d l " UT| P " " f i n j z v.u khi hị Ư, d i e bvi [-1)1.\ ,!ã
Nhin chung, các ion kim loại được nghiên cứu cóm Ca:’ M V- r '• V - V
Cd dểu co tác d u n g k h ỏ i p h u c h o a itin h 'riTvm T l i ' ' • • ' ■ l>ív
nhau v^hùPu là^p^cbíng enÍym ^RÒ\ = ồml ímn ■ í k d ■ h'K
N i- . Mn , Mg và Ca h'mh 6a). N«, , ? : M - r0Ilg dó’ tdc đun- rũ rct nhất la các iõn
ion Co va Mil’* rnn rn f I , - g ‘ pluic Ịl0;í t tính dối voi hang Rm = 0 osrl
ẽ i ế p ỆểlẺẵl ,"n g den £ tong pro, L h Cd, ’ ' nh 6c)- Ciic i0n 1 c Ể Ế Pb ẫ ỉ i ẽẵn Ê « 5ẳ Ễl
( c) - (d)
Hình 6. Điện di proteinaz trên gel polyacrylamit 7,5% có SDS và gelatin ‘0,1%: thành phần proteinaz trong dịch ngoại bào vi khuẩn p . ỉum inescens Hp chịu ảnh hưởng của một số ion kim loai
sau khi bị ức chế bởi EDTA
Giếng I. 5: ĐC- H;0 ; 2. 6: ĐC- EDTA; 3. 7: proteinaz sau khi ủ với EDTA được ù với lO ’M ion kim loại: 4. 8: proteinaz sau khi ủ với EDTA được ù với 2.5.10'-’M ion kim loai. Sau khi điện di. một nửa ban gel (các giếng 1-4) dược ù trong dung dịch đệm Glycine- NaOH 0,1M pH 8,0; nừa bản gel còn lai (các giếns 5- 8) dược ù trong đệm trên có bổ xung 2.5. lO'-’M ion kim loại tương ứng. (a): Nr*; (b): Co2*; (c): Mn:’; id): Fe:'
Kết quả nghiên cứu ở trên đã cho thấy dịch ngoại bào vi khuẩn p.ỉu tn in e sc en s Hp chứa các
bi ức chế bời cả EDTA và PMSF. Theo phán loại của Harley (1960), các proteinaz nãy thuộc
-Ncrm cũng ửả dược lìm thấy ỏ vi khuàn ỉìanllus pumiỉus [41 và ,-:ir , ,
trùng (Xctiorhubdiis s p p C A ) [7 91 Car h n o . I 1 lUan smh
" h ó n g Ị Ó , i j ^ o l c L X é r i n 8 P r* ,,K' 2 l h “ ỏ t k h u ™ <- 11 * b ' - * * K » i - N I S . "
91. có r i " i t ó í ' t r t ' r r iicí : ing.':1 " T* s , nh™ >7 «■
X ™ z ' ™ è Z * V ™ “ íi' % "*Ịị ,Ị:
vưc chính (I II III) V ơ i vi khn'in V 1 1 I c ộ n g s i nh với tu\ẽn t rùng (lếu p h a n bò llìành ha khu
không bi ưc chế boi FnTA ì ị CA [1- ’> ' hì ^ 1 ™ ^ ' í kl.u vuc I
hÍ w M " ,“ g , pro" ' , w ™ n* w * ™ « . S * J h
7 7 7 “ * » * c h í- Ngưực lai. các p r a a n a z hu.ic thu I a n? i , A ^ PM Sĩ . * ^ m ặ . . h nhưng cdc cnzyn, „:,y 3 . 7 l l . l 1 I p „ h, . ? i , A ^ PM Sĩ . * ^ m ặ . . h nhưng cdc cnzyn, „:,y 3 . 7 l l . l 1 I p „ h, .
dịch ngoại bào chứa các proteinaz có thành phàn khá khác nhau K Ế T L U Ậ N
1. Hoạt độ proteinaz dịch ngoại bào vi khuẩn p l u m i n e s c e n t 1 Ip manh nhất ở pi 1 8 0.
2- Enzym trong dịch ngoại bào rát kém bén nhiệt, sau 5 phút ú ờ 60"C. hoat dô proieina/. chi còn khoảng khoảng 50% !\oạt độ ban đầu.
3. Enzym bị ưc chẽ mạnh khi ù với ion IIg :\ sau dó đèn C i r \ N i:+, Zn2’ \'à C o2'. Ngươc lai các ion Mn *, Ca và Fe * đã làm tăng hoạt độ cn/ym .
^ 4. Các enzym trong dịch ngoại bào vi khuẩn p .h m ú n e sc cn s Hp chu yếu thuộc nhóm p r o te i n a z
xêrin và nhom proteinaz kim loại. Đ iện di trên gel polyacrylamit đã cho phép nhận iháy hai hãng proteinaz bị ức chế bởi cả P M S F và E D T A .
TÀI LIÊU THAM KHẢO
1. Forst S., Dowds B., Boemare N., Stackebrandt E. A n n a R e v M i c r o b i o l . N„51 (19 97), pp 47- 72.
2. Hartley B.S., 1960. An/Ill. Rev. Biochem., V.29, N„60, pp 45-72,
3. Heussen c . and Dowdle E.B., Anal. Biochem., V.102 (1980). pp 196-202.