II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.Xác định thành phần protein azb ằng điện d
Đê’ đi s â u p h â n tích t h à n h p h ấ n pr ot einaz có trong dịch nuỏi cáv vi khuẩn, c h u n g tôĩ đ ã tiên hanh điện di trên gel polyacr ylami t có S D S và có cơ chãt gelatin 0.1 % (hỉnh 3). C a c bâng e n z y m đươc n h â n thấy
trẽn b à n g e l n ằ m t r o n g 3 v ù n g (I, II v à III) với đ ộ di đ ộ n g đ i è n di tương ứng b ằ n g : ( 0 - 0 , 0 8 ) , ( 0 , 0 9 - 0 . 2 0 ) va
( 0, 25- 0, 31) . Tr ong đ ó c á c b â n q trong vùng II t hể hiện hoat độ m a n h nhất, c h ú n g bị ức c h ẻ m ạ n h bỡi cà EDTA và P M S F Ngươc lai, hai loai c h ấ t ức c h ê nà y đ é u khóng ức c h ê c á c b ã n g trong vùng !. Tuy nhiên, c á c b à n g trong vù n g II! bị ức c h è m a n h khi ù với P MS F nhưng c ũng bi ức c h ế mót p h á n bời EDTA
Hình 3 Điện đi pr o t e i n a z trẽn qel polyacrylamit có S D S va có cơ c hất gelatin 0 , 1% Ảnh hưỡng c u a EDTA và P M S F lẻn hoat đỏ c ù a pr ot ei naz tronq dịch nuối cây vi kh u â n X c n o r h a b d u s s ọ CA
C h u tlvch trèn hmti chôn ch crónr, 1 đoi t.hưr,,-] EŨTA :
De đ a n h gia a n h hương c ủ a c a c lon kim loại hũ,) In h,'i. đõ. .'ơ! Ccí : V’ÍJ r ĩ : • [ • EDTA m á u n ạ h i è n CỨLI dươc điên di trên gel polyacrylamil CO 5 D S /a co o : chai lim 0 1% Cliuíĩn ỉ
mau như sau má., riươc u VƠI EDTA VƠI nong đỏ CUÕI cúng Iro.-.rj nón hr.ip ; hán ,r';; b v . n 10 r.: iron , • - phut, sau do bo sung lon kim loai VỚI nong 'ỉõ CUỐI runrj bãnạ 10 [.1 2 5 10 u I r 10 r.1 Ỳ■ t i: I j 1
cho thảy: c á c ion C a - ' , Ba/ ' . Mg ' Mrỵ", Pb' • dã lam lăng rò ret hoat do e n / , ' n t húor III r . r ion Ml c d , F r y , Cu ' , Co ■ Ihe hièri a n h hương khỏng rõ rang. Điéu đ a n g lưu y la c a c ion C.T ’ Ba' • r.ly • l.!n • chi a n h hương đ e n hont độ c ủ a b â n g pr ot einaz 0,25, con Pb ■ chì có tar dung dúi 71.11 b . j nj (I 3 1 Tu nhién, c h u n g loi chưn lim t háy ion Kim lom n a o có tác dụ n g khỏi phuc hoai tinh CŨ.1 r ,ÌC b' mq ẽ n / rn /UIKI II (hinh 4).
Hình 4 Đ i ệ n di p r o t e i n a z trên cjel p o l y a c r y l a m i t có S D S v à co cơ chất ge la ti n 0 1% A n h hường c ủ a cac If.il ki m loại đỏi với h o ạ t đ ỏ p r o t e i n a z c ù a vi k h u ẩ n X e n o r h a b d u s s p C A S.III khi bi Lfc c.he bời E D T A
C h u t h í c h t r ẽ n h ì n h ơ i ẽ n ƠI/ giếng 1, 5: dõi ch ứn g nước; 2, 6: đối chửng EDTA 3 7 / a 4 8 proioina? sau
Khi bị ức c h ế bời EOTA đ ư ợ c ủ với ion kim loai nống độ 2,5. 10 M va 5. 10 'M, lương ưng. S a u khi điện di nửa bà n gel (có c á c gi êng 1-4) dược ủ với đ ệ m glyci n-NaOH 0,1M pH 8,0 không có ion kim loai nửa bàn gel (có c á c giêng 5-8) đ ư ợc ủ với đ ệ m trên, có ion kim loai nóng đô 2.5. 10 ‘M (a): Ca ', (b) B a ; ' (c) Mg? . (d): Mrv” , (e): P b / , l (f): Ni' 1, (g): C d 1", (h>: F e "
C á c nghi ên cứu từ trước đ ế u cho biết vi k h u ẩ n c õng sinh với tuyến trùng tiết ra mòt lương lớn proteinaz trong mỏi trường nuỏi cấy [2,7,8,9,10,11,12]. C á c prot einaz này đươc phán loại thuôc prot einaz kiềm với pH thích hơp b ằ n g 8 va t h u õ c n h ó m pr ot ei naz kim loại do ch ú n g bị ức c h ẽ mạ n h bời EOTA, chúng không bị ức c h ẽ bởi PMSF[ 8, 10]. Tuy nhiên, rất ít cô n g trinh nghi ên cứu đi sảu p h à n tích t hà nh p há n prot einaz ngoại b à o c ủ a vi k h u ẩ n c ộ n g sinh với t uyến trùng. Trong nghi ên cửu này, ch ú n g tòi n h ậ n (háy proteinaz ngoai b a o c ủ a X e n o r h a b d u s s p . CA. không những bị ức c h ế m a n h bời EDTA ma c on bị ức chẽ mạnh bởi PMSF. B ằ n g kỹ thuật đi èn di prot einaz, c h ú n g tỏi đã xãc định đươc t hanh ph â n c ủ a prot einaz trong đó b ă n g pr ot ei naz có ho ạ t đ ộ m ạ n h nhất t h u ộ c vùng II bị ức c h ế ma n h bời c à EDTA va PMSF, con c á c băng pr ot ei naz t rong vùng III bị ức c h ê m ạ n h bởi P MS F nhưng c ũng bị ức c h ế một p h ạ n bời EDTA. Nghiên cứu ả n h hưởng c ủ a c á c ion kim loai đ ế n ho a t độ prot ei naz đ ã cho thảy c á c ion C a ?\ B a ?‘, Mg?\ Mrrỉ' có tác d ụ n g khỏi p h u c ho ạ t tính c ủ a b á n g 0, 25 s a u khi bị ức c h ế bỏi EDTA, còn P b 2' chỉ co tác dụng với b ă n g 0 31. Vì vậy, có t hể cho rằng hai b â n g nà y t huộc loại pr ot ei naz kim loại-xêrin n h ư đ ả đươc tìm thấy ở vi k h u ẩ n B a c i l l u s p u m i l u s [3). Bước tiếp t h e o c ấ n phải tinh s ạ c h , nghi ên cứu tính chãt và c á u trúc của p h ả n tử prot einaz.
IV. KẾT LUẬN
1. B ằ n g kỹ thuật đi ện di trên gel polyacrylamit có S D S vã có gelatin 0, 1% đã xác định đươcpr ot e i na z ngoai b a o c ủ a vi k h u ẩ n X e n o r h a b d u s S P - CA g ổ m 3 vùng (I, II va 111) VỚ! đó di đóng pr ot e i na z ngoai b a o c ủ a vi k h u ẩ n X e n o r h a b d u s S P - CA g ổ m 3 vùng (I, II va 111) VỚ! đó di đóng đi ên di tương ứng bằng- (0-0,08), ( 0, 09- 0, 20) va (0,25-0,31)
2 C á c b ă n g trong vùng II t h ể hiện ho ạ t d ỏ ma n h nhất, c h ú n g bi ức c h ế m a n h bời cả EDTA va P MS F . C á c b â n g trong vùng III bị ức c h ê m ạ n h khi ủ với P MS F nhưng c ũng bị ức c h ế mòt p h ầ n bởi EDTA. C h ú n g t h u õ c loai pr ot einaz kìm loại-xẽrin.
V T À I L IỆ U T H A M K H Ả O1. B o e m a r e N. A G i v a u d a n , B r e h e t i n M a n d c L a u m o n d , 1997. S y m b i o s i s , 22 2 1 - 4 5 1. B o e m a r e N. A G i v a u d a n , B r e h e t i n M a n d c L a u m o n d , 1997. S y m b i o s i s , 22 2 1 - 4 5 2 C a l d a s c A C h e r q u i , A P e r e i r a , N S i m o e s . 2 0 0 2 A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y , 6 8 ( 3 ) 1 2 9 7 - 1 3 0 4 . 3 P h a m T h i T r à n C h â u a n d U r b a n e k H , 1 97 4 A c t a M i c r o b i o l o g i c a P o l o m c a S e r B 5 ( 2 3 ) 1 2 1 - 2 5 4. N g u y ễ n N g o e C h â u . 1 9 9 8 T a p c h í k h o a h o c v á c ó n g n g h è , X X X V h .3 ) 2 4 -2 9 . 5 N g u y ễ n N g o e C h â u . N g u y ễ n V ũ T h a n h Lai P h u H o a n g , P h a n K ế L o n g , 1 9 9 9 T a p ch s i n h h o c 21 ( 2 b ; 9 0 - 9 5 6 F o r s t s . a n d K N e a l s o n 1 9 9 6 M i c r o b i o l R e v , 6 0 3 1 - 4 3 7 O n g K L . F . N . C h a n g , 1 9 9 7 E l e c t r o p h o r e s i s , 18 8 3 4 - 8 3 5 8 S c h m i d t T M B B l e a k l e y d n d K H 1988 A p p l i e d 3.-1 E r , Y 9 T r i n h H ò n g T h a i , N g u i ẻ n H o a i H a =■!;j T Thi T r a n c h a n s r h [■ ' 2 fc ' . ' 3 - 1 7 S
10 T n n h H T h a i . R A B o i g e g r a - n M B r e h ^ n . 2 0 0 1 J G e n e t i c s a r . i A p p l i c a ! - s S p e ; : c o V . E •