3.2.1. Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của VGB
Để xác ñịnh thể tích thể tích MT, nghiên cứu này ñã sử dụng 8 loạt VGB trong tổng số 13 loạt sản xuất trong hai năm 2008-2009. Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của tất cả các loạt này như sau:
Bảng 3.28: Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của VGB
STT các
loạt Thimerosal (%) Formaldehyd (%)
1 0,0057 0,0000035
2 0,0058 0,0000034
3 0,0061 0,0000043
STT các
loạt Thimerosal (%) Formaldehyd (%)
5 0,0059 0,0000000 6 0,0058 0,0000027 7 0,0059 0,0000263 8 0,0060 0,0000170 9 0,006 0,0000271 10 0,006 0,0000540 11 0,0059 0.0000000 12 0,0059 0,0000159 13 0,0059 0,0000290 N = 13 ± s = 0,005916 ± 0,0005 ± s = 0,0000146 ± 0,0000159 p < 0,001
Trong VGB, hàm lượng thimerosal lớn hơn hàm lượng formaldehyd một cách có ý nghĩa thống kê với p < 0,001.
3.2.1. Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của VNNB
Để xác ñịnh thể tích thể tích MT, nghiên cứu này ñã sử dụng 8 loạt VNNB trong tổng số 12 loạt sản xuất trong hai năm 2008-2009.
Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của tất cả các loạt này như sau:
Bảng 3.29: Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của VNNB
STT
các loạt Thimerosal (%) Formaldehyd (%)
1 0,00489 0,0000232 2 0,00464 0,0000154 3 0,00487 0,0000107 4 0,00486 0,0000326 5 0,00496 0,0000000 6 0,00513 0,0000000 7 0.00494 0,0000000 8 0,00495 0,0000000 9 0,00454 0,0000174 10 0,00467 0,0000159 11 0,00493 0,0000331 12 0,0048 0,0000000 n = 12 ± s = 0,004848 ± 0,000163 ± s = 0,00001277 ± 0,0000127 p < 0,001
Trong VNNB, hàm lượng thimerosal cũng lớn hơn hàm lượng formaldehyd một cách có ý nghĩa thống kê với p < 0,001.
3.3. Qui trình xác ñịnh thể tích MT thích hợp ñể kiểm tra vô trùng vắc xin
Các VX không chứa thimerosal, qui trình xác ñịnh thể tích vẫn theo như sơ ñồ 2.1, như ñã làm trong nghiên cứu này.
Các VX có chứa thimerosal, chỉ xác ñịnh thể tích FTM, không xác ñịnh thể tích TSB. Thay thế toàn bộ TSB bằng FTM ñể kiểm tra vô trùng VX chứa thimerosal.
3.3.1. Chuẩn bị
- Chuẩn bị chủng mẫu ở nồng ñộ ~ 1000 CFU/mL. - Pha chế các loại môi trường.
3.3.2. Các bước tiến hành
3.3.2.1. Vắc xin không chứa thimerosal
- Bước 1: Thực hiện thử nghiệm ức chế với thể tích hiện tại: 20 mL/ống.
- Bước 2:
+ Nếu thể tích hiện tại ñạt yêu cầu: 100% số ống MT cấy VX có dấu hiệu mọc của chủng mẫu. Khẳng ñịnh thể tích trên với 2 loạt VX khác.
+ Nếu thể tích hiện tại không ñạt yêu cầu, tăng thể tích hai MT (30 mL/ống, 40 mL/ống, 50 mL/ống,...). Thực hiện thử nghiệm ức chế với các thể
tích này ñể tìm thể tích thích hợp.
Khi ñã tìm ñược thể tích thích hợp, khẳng ñịnh thể tích ñó với 2 loạt VX khác.
3.3.2.2. Vắc xin có chứa thimerosal
- Bước 1: Thực hiện thử nghiệm ức chế với thể tích hiện tại: 20 mL/ống.
- Bước 2:
+ Nếu thể tích hiện tại ñạt yêu cầu. Khẳng ñịnh thể tích trên với 2 loạt VX khác.
+ Nếu thể tích hiện tại không ñạt yêu cầu: chỉ ñi tìm thể tích thích hợp của môi trường FTM, không tìm thể tích thích hợp của môi trường TSB nữa. Khi kiểm tra vô trùng VX sẽ thay thế toàn bộ TSB bằng FTM và ủ môi trường FTM này ở nhiệt ñộ 20-250
C.
Tăng thể tích môi trường FTM (30 mL/ống, 40 mL/ống, 50 mL/ống,...). Thực hiện thử nghiệm ức chế với các thể tích này ñể tìm thể tích thích hợp.
Khi ñã tìm ñược thể tích thích hợp, khẳng ñịnh thể tích ñó với 2 loạt VX khác.
Chương 4:
BÀN LUẬN
Tất cả trang thiết bị, dụng cụ sử dụng trong ñề tài (máy ñóng ống MT, các tủ ấm, tủ lạnh, tủ âm sâu, lò hấp, lò sấy tiệt trùng, pipét man, pipét thuỷ tinh,…) ñều ñược thẩm ñịnh, chuẩn ñịnh và cấp chứng nhận cho từng trang thiết bị, dụng cụ bởi Trung tâm Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam. KĐQG ñã thực hiện theo ISO 17025.
Các tủ ấm, tủ lạnh, tủ âm sâu ñược theo dõi và ghi chép nhiệt ñộ hàng ngày, hai lần/ngày.
Chính vì những nhân tố trên mà kết quả nghiên cứu có ñộ tin cậy cao do thể tích MT trong mỗi ống ñảm bảo, nhiệt ñộ nuôi cấy ñảm bảo, ñộ sống của chủng ổn ñịnh,…
1. Về thể tích môi trường
Trong 4 VX, chỉ có BCG là có thể tích MT tìm ñược giống với thể tích ñang sử dụng ñể kiểm tra vô trùng. Ba VX còn lại, thể tích MT tìm ñược lớn hơn thể tích hiện tại. Thể tích MT tìm ñược của OPV là 30 mL, gấp 1,5 lần thể tích hiện tại; thể tích FTM tìm ñược của VGB (40 mL) gấp 2 lần thể tích hiện tại; thể tích FTM tìm ñược của VNNB (60 mL) gấp 3 lần thể tích hện tại.
Thử nghiệm kiểm tra vô trùng BCG cho kết quả ñúng.
Thử nghiệm vô trùng của ba OPV, VGB, VNNB có nguy cơ không phát hiện ñược các loạt VX nhiễm trùng, cho kết quả âm tính giả. Do ñó, qui trình kiểm tra vô trùng của 3 VX này cần phải thay ñổi.
Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Dược ñiển Mỹ, Anh, châu Âu coi vô trùng là tiêu chí quan trọng hàng ñầu ñể ñánh giá chất lượng VX [76].
Do vậy, tăng thể tích MT trong thử nghiệm kiểm tra vô trùng các VX này là cần thiết.
Thể tích tìm ñược của OPV, VGB, VNNB lớn hơn thể tích hiện tại không có nghĩa là kết quả kiểm tra vô trùng ba VX này của KĐQG hoàn toàn vô giá trị. Ở thể tích MT hiện nay, thử nghiệm kiểm tra vô trùng của ba VX này vẫn phát hiện ñược vi khuẩn và nấm trong VX nhưng tỷ lệ thấp hơn thể tích tìm ra trong nghiên cứu này. Áp dụng kết quả thẩm ñịnh làm cho thử nghiệm kiểm tra vô trùng VX ñược thực hiện trong ñiều kiện tốt nhất, ñạt kết quả tin cậy nhất [52].
Các qui trình chuẩn (SOP) ñược dùng trong sản xuất và kiểm ñịnh VX với ý nghĩa là các qui trình chính thống trong một thời ñiểm nhất ñịnh, ñã ñược phê duyệt và có tính chất pháp lý. Từ “chuẩn” ở ñây không có nghĩa là ñúng hoàn toàn và không cần sửa ñổi. Hàng năm, theo yêu cầu của WHO và ISO 17025, KĐQG ñều tiến hành xoát sét và sửa chữa những nội dung chưa hợp lý.
Với FTM, thể tích 20 mL/ống, 30 mL/ống, 40 mL/ống và 60 mL/ống là hoàn toàn có thể áp dụng ñược trong thực tế kiểm tra vô trùng VX. Thể tích FTM 100 ml/ống cũng ñã ñược áp dụng vào thực tế Việt Nam tại POLYVAC ñể kiểm tra vô trùng VX sởi.
Với TSB, các thể tích thể tích 20 mL/ống, 30 mL/ống cũng hoàn toàn áp dụng ñược trong thực tế làm việc.
Thể tích TSB tìm ñược cho VGB là 80 mL/ống với thể tích VX cấy vào là 25 µL /ống MT (chia nhỏ 40 lần so với hiện tại). Thông thường, ñể kiểm tra vô trùng, mỗi loạt VGB sẽ dùng 20 ống VX ñể cấy vào TSB, tương ñương với 20 mL. Như vậy số ống TSB cần dùng ñể kiểm tra vô trùng 1 loạt VGB là: 20 x 40 = 800 ống.
Tương tự như vậy, thể tích TSB tìm ñược cho VNNB là 60 mL/ống với thể tích VX cấy vào là 20 µL/ống MT (chia nhỏ 50 lần so với hiện tại). Số ống TSB cần cho một lần kiểm tra vô trùng VNNB là: 20 x 50 = 1000 ống.
Số lượng ống MT quá lớn, không thể áp dụng vào thực tế.
Thể tích TSB tìm ñược của VGB là 80 mL với lượng VX cho vào mỗi ống MT là 25 µL tương ñương với thể tích môi trường là 3200 mL khi cấy 1 mL VX.
Thể tích TSB tìm ñược của VNNB là 60 mL với lượng VX cho vào mỗi ống MT là 20 µL tương ñương với thể tích MT là 3000 mL khi cấy 1 mL VX.
Để giảm số ống MT, cũng có thể dùng 20 ống TSB thể tích 3200 mL ñể kiểm tra vô trùng một loạt VGB và dùng 20 ống TSB thể tích 3000 mL ñể kiểm tra vô trùng một loạt VNNB.
3200 và 3000 mL là những thể tích rất lớn. Thể tích môi trường lớn hơn 2500 mL mà vẫn chưa loại bỏ hoàn toàn ñược ảnh hưởng của chất ức chế cũng ñược ñề cập ñến trong Dược ñiển Mỹ. Dược ñiển Mỹ giới hạn thể tích MT tối ña 2500 mL và khuyến cáo nếu thể tích tìm ñược lớn hơn 2500 mL thì sẽ kiểm tra vô trùng VX bằng thể tích 2500 mL [69].
Nếu làm theo khuyến cáo của Dược ñiển Mỹ, mỗi loạt VGB và VNNB sẽ dùng 20 lọ TSB thể tích 2500 mL, 20 lọ này chiếm diện tích rất lớn. Điều này cũng không thể thực hiện ñược trong thực tế kiểm tra vô trùng do không ñủ không gian và mất rất nhiều công sức, MT.
Vậy phải tìm ra một giải pháp khác ñể giải quyết vấn ñề này.
Vai trò của TSB trong thử nghiệm vô trùng là nhằm phát hiện VK hiếu khí và nấm. Trong khi ñó, trong các chứng dương, cả ba chủng mẫu phát triển rất tốt trong FTM (Bảng 3.2). Theo Bảng 3.22, 3.23, 3.24, 3.25, 3.26, 3.27 trong thử nghiệm ức chế VGB và VNNB, cả ba chủng mẫu (bao gồm cả C.
giảm thời gian, công sức, tài chính mà vẫn ñảm bảo ñược chất lượng công việc, trong những trường hợp VX có chứa thimerosal nên thay TSB bằng FTM. Điều này cũng phù hợp với SOP kiểm tra vô trùng của hãng Green Gross (Hàn Quốc) [48] và khuyến cáo của Cơ quan Y tế châu Âu (European
medicines agency: EMEA) [44].
Cũng có thể giải quyết vấn ñề thể tích MT quá lớn bằng cách dùng phương pháp màng lọc ñể kiểm tra vô trùng VNNB, nhưng cách này vẫn chưa ñược thực hiện tại KĐQG vì vấn ñề kinh tế. VGB thì không thể dùng phương pháp màng lọc ñể kiểm tra vô trùng ñược vì trong thành phần VX này có chứa hydroxyd nhôm. Tương tự như VGB, nhiều VX khác cũng không thể kiểm tra vô trùng bằng phương pháp màng lọc như TT, DPT (IVAC); Cevarix, Twinrix (GSK); Act-HIB, ADACEL, D.T.VAX (Sanofi pasteur); Gardasil
(Merck & Co., Inc);…
Thể tích FTM thích hợp ñể kiểm tra vô trùng DPT của Biofarma (Indonesia) là 40 mL [39]. Thể tích này có tính chất tham khảo do các VX trong nghiên cứu này và VX trong nghiên cứu của Biofarma là khác nhau, hàm lượng các chất ức chế khác nhau, ñiều kiện thực hiện thử nghiệm của hai nghiên cứu cũng khác nhau.
Trường hợp VX không chứa chất bảo quản, thể tích tìm ñược của FTM và TSB là như nhau: Thể tích FTM và TSB ñể kiểm tra vô trùng BCG ñều là 20 mL. Thể tích FTM và TSB ñể kiểm tra vô trùng OPV ñều là 30 mL.
BCG do IVAC sản xuất là VX không chứa chất ức chế: không có chất bảo quản, không có kháng sinh, không chứa chất bất hoạt trong quá trình sản xuất.
OPV không có chất bảo quản nhưng có chứa hai loại chất ức chế khác. Loại thứ nhất là phenol, ñây là chất chỉ thị màu trong công ñoạn gây nhiễm vi rút lên tế bào của quá trình sản xuất. Loại thứ hai là kháng sinh: kanamycin,
neomycin dưới dạng vết. Thể tích FTM và TSB là như nhau do FTM và TSB ñều không chứa chất trung hòa ñặc hiệu phenol, kanamycin, neomycin.
Các VX có chứa thimerosal, thể tích của TSB lớn hơn hẳn FTM.
Sự khác nhau về thể tích MT là do khác nhau về thành phần của 2 MT: FTM có chứa sodium thioglycolat và L-cystine có tác dụng trung hoà bớt một phần thimerosal có trong vắc xin, TSB không chứa chất trung hòa nào.
Có ba cách ñể loại bỏ ảnh hưởng của chất ức chế trong thử nghiệm vô trùng: + Phương pháp trung hòa: cho thêm chất trung hoà vào MT,
+ Phương pháp hòa loãng: tăng thể tích MT, + Kết hợp hai cách trên [69].
Khi VX chứa thimerosal, nếu chỉ dùng phương pháp hòa loãng ñể loại bỏ ảnh hưởng của chất ức chế như trường hợp TSB thì thể tích MT tìm ñược rất lớn, không thể áp dụng vào thực tế kiểm tra vô trùng. FTM là sự kết hợp cả hai phương pháp: tăng thể tích MT và trung hòa bớt một phần thimerosal bằng chất trung hòa ñặc hiệu.
Thể tích FTM và TSB giữa các VX cũng không giống nhau.
Hai VX không chứa chất bảo quản, thể tích MT tìm ñược của OPV lớn hơn BCG. Điều này có thể lý giải ñược vì BCG hoàn toàn không chứa chất ức chế nào ñã biết. OPV chứa phenol, kanamycin và neomycin. Mặc dù kanamycin và neomycin chỉ có trong VX dưới dạng vết nhưng cùng với phenol, thể tích môi trường ñã phải tăng thêm 10 mL mỗi ống mới loại bỏ ñược ảnh hưởng của các chất này.
Trong nghiên cứu này, nồng ñộ phenol trong OPV không ñược xác ñịnh nên không biết mức ñộ ảnh hưởng của phenol lên thể tích MT như thế nào.
Phenol ñóng vai trò là chất chỉ thị màu trong quá trình nuôi cấy vi rút. Để giảm thiểu tác dụng phụ của VX ñối với người sử dụng, nên loại bỏ
phenol trong những công ñoạn cuối của quá trình sản xuất. Với VX sởi, POLYVAC ñã loại bỏ ñược phenol ở cuối giai ñoạn sản xuất. Việc sản xuất OPV vẫn theo qui trình cũ nên không có công ñoạn loại bỏ phenol.
Nghiên cứu này chỉ thực hiện trên 4 VX. Còn rất nhiều VX chưa ñược xác ñịnh thể tích MT thích hợp ñể kiểm tra vô trùng. Trong khi chưa thể xác ñịnh ñược ngay thể tích MT cho từng VX, chúng ta có thể áp dụng thể tích tìm ñược cho các VX cùng nhóm. Cụ thể:
- Dùng MT thể tích 20 mL/ống ñể kiểm tra vô trùng cho các VX không chứa chất ức chế: ImBCG (IVAC); rất nhiều các VX vi khuẩn ngoại nhập như HIBERIX (GSK), Infantrix (GSK), Act-HIB (Sanofi Pasteur), Menigococcal A+C (Sanofi Pasteur), Quinvaxem (Berna Biotech Ltd, Korea).
- Dùng MT thể tích 30 mL ñể kiểm tra vô trùng các VX không chứa chất bảo quản nhưng có chứa kháng sinh (phần lớn các VX vi rút).
- Các VX chứa thimerosal: không dùng TSB, chỉ dùng FTM thể tích ít nhất 40 mL ñể kiểm tra vô trùng. Một nửa số ống FTM vẫn ủ ở nhiệt ñộ 30-350C, một nửa ủ ở nhiệt ñộ 20-250C.
Bằng cách này, KĐQG sẽ giải quyết ñược rất nhiều VX.
Thể tích MT tìm ñược ñể kiểm tra vô trùng các VX này chỉ có tính chất tham khảo ñối với nhà sản xuất.
Thử nghiệm ức chế ñược yêu cầu thực hiện trong các trường hợp sau: + Đối với sản phẩm mới.
+ Khi có bất kỳ sự thay ñổi nào trong ñiều kiện thực hiện thử nghiệm vô trùng: con người, dụng cụ, ñịa ñiểm thực hiện thử nghiệm,...
+ Theo yêu cầu của GLP: cứ 12 tháng nhắc lại một lần [58], [67].
Cũng vì lý do này mà thể tích MT ñể kiểm tra vô trùng giữa các VX có thể không giống nhau. Thậm chí, cùng một VX nhưng giữa các labo khác nhau thì thể tích MT cũng có thể khác nhau vì ñiều kiện thực hiện thử nghiệm
là hoàn toàn khác nhau: con người khác nhau; dụng cụ, trang thiết bị khác nhau; MT ñược pha chế từ MT bột của các hãng sản xuất khác nhau, các loạt MT ñược hấp tiệt trùng bằng những lò hấp khác nhau;...Thể tích MT tìm ñược của labo này chỉ có tác dụng tham khảo ñối với labo khác, mỗi labo phải tự xác ñịnh thể tích MT cho riêng mình. Với cùng một VX, KĐQG và nhà sản xuất ñều phải xác ñịnh thể tích MT của mình.
Nghiên cứu sử dụng ba chủng mẫu:
Khả năng chịu ảnh hưởng chất ức chế của ba chủng là khác nhau. Chủng B. subtilis ít chịu ảnh hưởng của các chất ức chế, C. albicans và
K. rhizophila chịu ảnh hưởng nhiều hơn.
Hình thái phát triển của chủng trong các ống MT là khác nhau giữa các chủng và khác nhau giữa các MT.
Đáy ống FTM là môi trường yếm khí nên cả 3 chủng ñều phát triển ở phía trên của ống MT. Cả 3 chủng ñều là chủng hiếu khí nên khi phát triển ñều làm mất chỉ thị màu của FTM. Chỉ thị màu mất nhiều hay ít tương ứng với mức ñộ phát triển chủng chủng.
Trong TSB, B. subtilis chỉ phát triển ở phía trên ống MT. C. albicans chủ yếu lắng cặn ở ñáy ống MT, phần MT phía trên vẫn trong. K. rhizophila vừa lắng cặn ở ñáy ống TSB, vừa làm ñục MT.
Nghiên cứu này giữ chủng bằng phương pháp ñông băng: bảo quản