1.3.5.1. Các chứng âm
Thử nghiệm vô trùng có ba chứng âm, ñó là:
- Chứng âm của sản phẩm,
- Giám sát môi trường làm việc (Environment) [58].
Chứng âm ñược thực hiện ñể nhận ra những trường hợp dương tính giả: VX hoàn toàn vô trùng nhưng lại có dấu hiệu phát triển của VK hoặc nấm hoặc cả VK và nấm trong các ống MT nuôi cấy. Điều này xảy ra do bị nhiễm VK và nấm từ bên ngoài trong quá trình thực hiện thử nghiệm.
Giám sát môi trường làm việc (ñếm số lượng VK và nấm trong không khí; ñếm số lượng VK và nấm trên bề mặt tủ cấy vô trùng, găng của cán bộ thực hiện thử nghiệm; ñếm số lượng hạt bụi trong không khí) nhằm ñánh giá xem có nguy cơ nhiễm vi khuẩn và nấm từ bên ngoài vào các lọ MT cấy VX trong quá trình kiểm tra vô trùng hay không.
Chứng âm của sản phẩm là những lọ có ñặc ñiểm, hình dạng, kích thước giống các lọ VX cần kiểm tra vô trùng, thông thường là 10 lọ. Người ta cho rằng các lọ này chắc chắn vô trùng vì ñã ñược tiệt trùng kép bằng cách hấp tiệt trùng hai lần, sấy tiệt trùng hai lần hoặc dùng tia gam ma cường ñộ 50 kGy. Chứng âm của sản phẩm ñược thao tác ñồng thời với sản phẩm trong quá trình kiểm tra vô trùng. Nếu trong các ống MT cấy chứng âm có dấu hiệu mọc của vi khuẩn hoặc nấm thì chứng tỏ thử nghiệm không có giá trị.
1.3.5.2. Các chứng dương
Thử nghiệm vô trùng cũng có ba chứng dương, bao gồm các thử nghiệm theo thứ tự thực hiện như sau:
- Thử nghiệm kiểm tra dinh dưỡng môi trường (Growth promotion test),
- Thử nghiệm ức chế. Thử nghiệm ức chế cũng ñược dùng với tên khác
là thử nghiệm thẩm ñịnh (Validation test) hoặc thử nghiệm thích hợp (Suitability test) ,
Các chứng dương này ñược thực hiện nhằm xác ñịnh những trường hợp âm tính giả: VX bị nhiễm VK hoặc nấm hoặc thậm chí cả VK và nấm nhưng chúng không mọc ñược trong MT nuôi cấy.
Thử nghiệm kiểm tra dinh dưỡng môi trường ñược thực hiện nhằm ñánh giá chất lượng MT thông qua sự phát triển của chủng mẫu trong MT sử dụng, bằng cách cho vào mỗi ống MT từ 10-100 CFU chủng mẫu. Thử nghiệm kiểm tra dinh dưỡng môi trường ñược yêu cầu thực hiện ñối với tất cả các loạt MT. Trong ñó, FTM cần ñược kiểm tra với ít nhất một chủng VK hiếu khí và một chủng VK kỵ khí, TSB cần ñược kiểm tra với ít nhất một chủng VK hiếu khí và một chủng nấm [43].
Thử nghiệm ức chế hay thử nghiệm thẩm ñịnh ñánh giá sự phát triển của chủng trong MT khi có mặt của VX. Thử nghiệm ức chế ñược thực hiện bằng cách cho VX vào MT, sau ñó cho 10-100 CFU chủng mẫu vào mỗi ống MT rồi ñánh giá sự phát triển của chúng [53], [58], [67].
Thử nghiệm ức chế ñược thiết kế ñể thẩm ñịnh thử nghiệm vô trùng bằng cách chứng minh rằng nếu có vi khuẩn và nấm trong sản phẩm thì sẽ phát hiện ñược trong thử nghiệm vô trùng [56].
Trong thử nghiệm ức chế, thử nghiệm kiểm tra vô trùng môi trường sẽ ñóng vai trò là một chứng âm ñể chứng minh MT sử dụng không chứa VK và nấm; thử nghiệm kiểm tra dinh dưỡng môi trường ñược sử dụng với vai trò như một chứng dương, chứng tỏ MT có khả năng giúp cho chủng mẫu phát triển và chứng tỏ chủng mẫu có thể phát triển tốt trong MT [67].
Phương pháp thực hiện thử nghiệm ức chế, kiểm tra dinh dưỡng môi trường và thử nghiệm duy trì ñã ñược ghi trong Dược ñiển Châu Âu, Dược ñiển Mỹ, ICH,..
Thử nghiệm duy trì ñược thực hiện bằng cách cho từ 10-100 CFU chủng mẫu vào mỗi ống MT sau khi ñã cấy VX ít nhất 14 ngày mà không có dấu hiệu phát triển của VK và nấm.
Thử nghiệm duy trì không phải là thử nghiệm bắt buộc nhưng nó là một thử nghiệm theo yêu cầu của thực hành phòng thí nghiệm tốt (Good laboratory practice: GLP) và tổ chức tiêu chuẩn quốc tế 17025 (17025 International Standard Organization: ISO 17025) nhằm chứng minh ở cuối giai ñoạn nuôi cấy trong thử nghiệm vô trùng, MT vẫn có khả năng giúp cho các chủng mẫu phát triển, do:
- Vẫn duy trì ñược các chất dinh dưỡng,
- Vẫn có khả năng loại bỏ ảnh hưởng của các chất ức chế có trong VX,
- Vẫn duy trì ñược ñiều kiện kỵ khí trong môi trường FTM.
Thử nghiệm duy trì ñược thực hiện sau khi ñã thực hiện thử nghiệm ức chế.
Thử nghiệm ức chế “nhại” lại thử nghiệm vô trùng một cách thích hợp ở tất cả các chi tiết như: thể tích MT sử dụng, thể tích VX cho vào mỗi ống MT, số lượng lọ VX,...[67].